Contenido 1 Pinyin 2 Referencia en inglés 3 Descripción general 4 Examen médico de electroforesis de hemoglobina 4.1 Nombre de la prueba 4.2 Clasificación 4.3 Recolección de material 4.4 Principio de determinación de la electroforesis de hemoglobina 4.5 Reactivos 4.5.1 Electroforesis de microhemoglobina: 4.5.2 Acetato de celulosa membrana Teñido electroforético y método colorimétrico: 4.6 Método de operación 4.6.1 Electroforesis de microhemoglobina: 4.6.2 Teñido electroforético de membrana de acetato de celulosa y método colorimétrico: 4.6.3 Electroforesis de membrana de fibra de ácido cerámico método colorimétrico directo 4.7 Valor normal 4.8 Importancia clínica de los resultados de laboratorio 4.9 Enfermedades relacionadas 1 Pinyin
xuè hóng dàn bái diàn yǒng 2 Referencia en inglés
HE
Electroforesis de hemoglobina 3 Descripción general
Varias hemoglobinas Tienen diferentes puntos isoeléctricos y pueden transportar diferentes cargas en un tampón con un cierto valor de pH. Está cargado negativamente en un tampón alcalino y cargado positivamente en caso contrario. En un determinado campo eléctrico, las moléculas de Hb con diferentes cargas pueden moverse hacia el electrodo positivo o negativo respectivamente, y sus velocidades de movimiento varían con la fuerza de la carga transportada por las moléculas de Hb. Como resultado, se forman varias zonas (patrones electroforéticos). . Se pueden identificar preliminarmente varias hemoglobinas anormales a partir de los patrones de electroforesis, y su contenido puede determinarse mediante colorimetría fotoeléctrica o escaneo. 4 Examen médico de electroforesis de hemoglobina 4.1 Nombre de la prueba
Electroforesis de hemoglobina
4.2 Clasificación
Análisis de sangre clínico> Glóbulos rojos 4.3 Recolección
Sangre 4.4 Principio de determinación de la electroforesis de hemoglobina
(1) Electroforesis de hemoglobina en microvolumen: cada componente de la hemoglobina tiene diferentes puntos isoeléctricos debido a la diferente naturaleza y cantidad de cargas en su superficie molecular. En el campo eléctrico de diferente pH, la velocidad de natación es diferente debido a la diferencia de carga. Esto permite separar los componentes de la hemoglobina. Si las moléculas de hemoglobina anormales tienen cambios de carga, aparecerán bandas anormales en otras partes del patrón de electroforesis normal para lograr el propósito de separación e identificación.
En el método de electroforesis, debido a los diferentes soportes utilizados, existen electroforesis en papel, electroforesis en agar, electroforesis en gel de almidón, electroforesis en placa de almidón, electroforesis en membrana de acetato de celulosa, etc. Los tampones de electroforesis utilizados incluyen tampón barbitúrico a pH 8,6 u 8,9 y tampón TEB a pH 9,1, 9,0, 8,9 y 8,5. Solución tampón de fosfato de pH 16,8 y 7,0, etc.
Actualmente, la electroforesis con membranas de acetato de celulosa es la primera opción en los laboratorios clínicos. Este método es simple de operar, tiene un tiempo de electroforesis corto y alta resolución, y a menudo se usa para detectar hemoglobina anormal. Si es necesario, utilice electroforesis ácida con tampón de pH 6,5 o pH 6-6,2 para identificar mejor la hemoglobina anormal.
(2) Identificación de cadenas peptídicas anormales (método de disociación de urea): después de agregar mercaptoetanol y urea a la solución de hemoglobina, los enlaces disulfuro en la molécula de hemoglobina se pueden reducir, se destruye la estructura espacial y la La globina se escinde para formar la subunidad de la cadena peptídica. Diferentes cadenas peptídicas tienen diferentes puntos isoeléctricos y diferentes movilidades, y se puede utilizar electroforesis para separar las cadenas peptídicas. Con este método también se pueden separar cadenas peptídicas anormales de hemoglobina anormal y se puede determinar el tipo de anomalía en función de su ubicación. 4.5 Reactivos 4.5.1 (1) Electroforesis de microhemoglobina:
① Tampón TEB (pH 8,5, para inmersión en membrana):
Tris 10,2 g EDTA 0,6 g
Ácido bórico 3,2 g Añadir agua destilada a 1000 ml
② Tampón BB (para tanque de electroforesis):
Bórax 6,87 g Ácido bórico 5,56 g
Añadir agua destilada a 1000ml
③Solución de hemoglobina: Diluir la solución de hemoglobina preparada según el método anterior a 30~50g/L.
④ Solución de colorante Ponceau:
1,8g de colorante Ponceau S, 26,8g de ácido tricloroacético
26,8g de ácido sulfosálico, añadir agua destilada a 1000ml
Esta es la solución de almacenamiento. Lo mejor es utilizar ampollas de 2 ml cada una. Diluir con 19 ml de agua destilada por ml de solución madre antes de usar.
⑤Solución decolorante: Solución de ácido acético al 3%.
⑥Solución transparente:
70 ml de etanol absoluto 30 ml de ácido acético glacial 4.5.2 (2) Método colorimétrico de tinción por electroforesis con membrana de acetato de celulosa:
① Tampón TEB y tampón BB Es lo mismo que la electroforesis de microhemoglobina.
②Solución colorante:
Amino negro 10B 0,5g Metanol 50ml
Ácido acético glacial 10ml Agua destilada 40ml
Disolver y conservar en un botella marrón en el interior.
③ Solución de enjuague:
Etanol (o metanol) 45ml ácido acético glacial 5ml
Agua destilada 50ml
④ Solución de lixiviación NaOH 0,4 mol/L.
(3) Identificación de cadenas peptídicas anormales (método de disociación de urea):
① Solución de disociación:
Urea 5,4g β-mercaptoetanol 2,0ml
p>
Añadir tampón TEB (para electroforesis de hemoglobina, pH 8,5) a 10ml
Colocar en el frigorífico para su uso posterior.
② Solución de inmersión:
Urea 48g Tris 1,14g
EDTANa2 0,12g Ácido bórico 0,32g
Añadir agua destilada a 100ml
p>
③Tampón de electroforesis (igual que el tampón BB para electroforesis de hemoglobina).
④Solución de tinción con rojo Ponceau (igual que la electroforesis de hemoglobina).
⑤ Deshidratación (igual que la electroforesis de hemoglobina). 4.6 Método de operación 4.6.1 (1) Electroforesis de microhemoglobina:
① Remojo de la membrana: haga flotar la membrana de acetato de celulosa en la superficie del tampón TEB, espere hasta que se empape uniformemente y se hunda, y luego úsela. durante al menos 20 minutos. Esto evita que se formen burbujas.
②Manchado: Sacar la membrana de fibra de acetato y utilizar papel de filtro para absorber el exceso de agua. Utilice una micropipeta para extraer la solución de hemoglobina y colóquela en la ranura cóncava del muestreador de muestras múltiples. Sumerja la solución de hemoglobina en el muestreador de muestras múltiples y coloque la muestra en la superficie mate de la membrana de acetato de celulosa. A una distancia de 1,5 a 2 cm del extremo del cátodo, el volumen de muestra es de aproximadamente 3 a 5 µl y se coloca en paralelo una solución de hemoglobina normal para el control.
③Electroforesis: agregue cantidades iguales de tampón BB a los tanques de tampón en ambos lados del tanque de microelectroforesis y use dos capas de papel de filtro como puente de sal para descansar sobre el soporte de la película de acetato de celulosa. Coloque el lado mate de la película hacia abajo, conecte el electrodo negativo al electrodo negativo y equilibre durante 5 minutos. Encienda la energía. El voltaje es de 180 V, la corriente es de aproximadamente 0,2 mA/cm de ancho de membrana y el tiempo de electroforesis es de 20 a 30 minutos. El tampón del tanque se puede volver a utilizar después de reemplazar el electrodo.
④ Teñido: la película después de la electroforesis se tiñe en una solución de tinción de rojo Ponceau durante unos 10 minutos, se retira, se enjuaga varias veces con ácido acético al 3% hasta que el fondo se vuelve blanco y se seca a la sombra.
⑤Transparente: Remoje la membrana de acetato de celulosa en un líquido transparente, péguela en una placa de vidrio limpia y use una varilla de vidrio para ahuyentar las burbujas de aire entre ambas. Vierta una pequeña cantidad de ácido acético glacial en un cilindro de cromatografía y cubra la placa de vidrio sobre el cilindro de cromatografía (con la película hacia adentro). Fumar con ácido acético glacial volátil durante 10 a 20 minutos y retirar cuando la película se vuelva transparente. 4.6.2 (2) Método colorimétrico de tinción por electroforesis con membrana de acetato de celulosa:
① Retire la membrana de acetato de celulosa de 4 cm × 6 cm empapada en tampón TEB y absorba el exceso de agua con papel de filtro. En la superficie mate a 1,5 cm del extremo del cátodo, use una pipeta de hemoglobina para dejar caer aproximadamente 5 μl de solución de Hb de 50 g/L de manera uniforme y ordenada en línea recta. Después de que la solución de hemoglobina penetre en la membrana, déle la vuelta y colóquela. en el puente de papel de filtro de la placa de soporte del tanque de electroforesis.
②Electroforesis: Voltaje 180V, tiempo 30-40min, sujeto a separación completa de cada zona de Hb. Después de la electroforesis, cambie los electrodos y el tampón de electroforesis se puede utilizar varias veces.
③Teñido: Sumerja la membrana en la solución de teñido. Debe teñirse durante 2 horas en invierno. En verano, la tina de teñido se puede colocar a 25 ~ 30 ℃. Sólo se puede teñir durante unos 30 minutos. Tenga en cuenta que si la tinción no es transparente (por ejemplo, el tiempo es demasiado corto o la solución de hemoglobina está demasiado concentrada), o el voltaje es demasiado alto y la banda de HbA está demasiado concentrada, la banda de color se desprenderá fácilmente. lo que afectará la precisión de la cuantificación. Después de teñir, lave con solución de enjuague varias veces hasta que se enjuague el fondo.
④ Cuantitativa: Sacar la membrana enjuagada, recortar cada zona y una zona de control equivalente al tamaño de HbA2, y colocarlas en los tubos de ensayo correspondientes. Agregue 10 ml de solución de lixiviación al tubo de HbA, agregue 2 ml de solución de lixiviación a cada uno de los otros tubos, déjelo en remojo durante 20 minutos y agite con frecuencia. Eluya la cinta por completo (tenga en cuenta que cuando la temperatura es alta, el tiempo de elución no debe ser demasiado largo; de lo contrario, el color azul del eluato se desvanecerá y gradualmente se volverá violeta). Mezclar el eluato uniformemente, utilizar un espectrofotómetro 721 con una longitud de onda de 620 nm, ajustar a cero con un blanco y medir la absorbancia de cada tubo.
⑤Cálculo: Igual que la colorimetría directa. 4.6.3 Método colorimétrico directo de electroforesis con membrana de cerato de celulosa
Reactivos: igual que la electroforesis de microhemoglobina con membrana de acetato de celulosa.
Funcionamiento:
(1) Cortar 1/3 de la membrana de acetato de celulosa (4cm×8cm) y remojarla en tampón TEB durante más de 10 minutos.
(2) Sacar la membrana de acetato de celulosa y utilizar papel de filtro para absorber el exceso de agua. Utilice una pipeta de Hb para absorber 10 l de hemolizado de 100 g/L y aplíquelo uniformemente en el borde inferior del portaobjetos de vidrio en la superficie mate de 1,5 a 2,0 cm del extremo del cátodo de la película. Haga dos copias de cada muestra al mismo tiempo.
(3) Electroforesis: El tampón es el mismo que el de la electroforesis de trazas de hemoglobina. Voltaje 180V, tiempo 40min~1h. (Se declara que cada zona está claramente separada) Después de la electroforesis, se intercambian los electrodos y el tampón se puede utilizar repetidamente.
(4) Elución y cuantificación: Recortar HbA, HbA2 y una zona de control equivalente al tamaño de HbA2. Si hay zonas de Hb anormales (HbX), también se cortan al mismo tiempo y se colocan en los tubos de ensayo correspondientes. Agregue 10 ml de tampón TEB al tubo de HbA, agregue 2 ml de tampón TEB a los tubos restantes, déjelos en remojo durante 30 minutos y agite con frecuencia. Después de la elución completa.
Mezclar el eluyente y utilizar un espectrofotómetro 721 con una longitud de onda de 413nm. Ajuste el blanco a cero y mida la absorbancia de cada tubo.
(5) Cálculo:
Si hay HbX anormal, al calcular el HbA2%, agregue: absorbancia de HbX al denominador.
HbX%＝ 4,7 valor normal
Método de electroforesis:
HbA 95 %
HbA2 1,1 % ~ 3,2 %
HbA3 2%～3%
Método de Singer: HbF<4% 4.8 Importancia clínica de los resultados de la prueba
(1) Aumento: talasemia mayor (aumento de HbA2 y HbF), Beta talasemia menor (HbA2 4% a 10%)
(2) Reducida (HbA2): anemia ferropénica, anemia sideroblástica. 4.9 Enfermedades relacionadas