Examen de ingreso de posgrado
Para facilitar la rápida comprensión de todos, revisé una gran cantidad de información y presenté soluciones genómicas comunes y procedimientos experimentales concisos en forma de texto e imágenes. Este número comparte métodos de detección de marcadores para genómica, proteómica, metabolómica y transcriptómica. Dejemos de tonterías y vayamos directamente a lo esencial.
1. Experimento de verificación de marcadores genómicos
1. Expresión genética
La PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) es un modelo para estudiar la expresión genética cuando el tamaño de la muestra es pequeño o muy valioso. Las principales ventajas de este método son el amplio rango, la alta sensibilidad, la alta precisión, la ausencia de pasos de procesamiento posteriores a la PCR, la evitación de la contaminación cruzada, el alto rendimiento y la detección múltiple. Específicamente, el análisis cuantitativo y cualitativo de la plantilla inicial se logra detectando la señal de fluorescencia de cada producto del ciclo en la reacción de amplificación por PCR en tiempo real. En las reacciones de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, se introducen sustancias químicas fluorescentes. A medida que avanza la reacción de PCR, los productos de la reacción de PCR continúan acumulándose y la intensidad de la señal de fluorescencia también aumenta en proporción. Después de cada ciclo, se recoge la señal de intensidad de fluorescencia, se detecta el cambio en la cantidad de producto a través del cambio en la intensidad de fluorescencia y finalmente se obtiene la curva de amplificación de fluorescencia. Para ideas experimentales, consulte la referencia [1].
Materiales experimentales
Tejidos y células frescas y congeladas, sangre o plasma fresco y congelado, etc.
? Los métodos de detección de expresión génica también incluyen PCR[2] y RT-PCR[3].
2.? Detección de metilación
La PCR (PCR específica de metilación (MSP)) es una tecnología de detección de metilación de ADN altamente sensible que no está limitada por enzimas de restricción. Por lo general, se diseñan dos pares de cebadores, un par de cebadores MSP. amplifica la plantilla de ADN tratada con bisulfito y el otro par amplifica el fragmento no metilado. Si el primer par de cebadores puede amplificar el fragmento, significa que el sitio de detección está metilado. El cebador puede amplificar el fragmento, lo que indica que el sitio de detección está metilado. no metilado
Materiales experimentales
Células o tejidos frescos, congelados e incluidos en parafina, etc.
Otras técnicas para la detección de metilación incluyen la secuenciación por tratamiento con bisulfito [. 5], análisis de enzimas de restricción combinadas con bisulfato de sodio (COBRA) [6], etc.
2 Experimento de verificación del etiquetado proteómico
Western blot consiste en transferir la proteína total de las células o. tejidos separados por electroforesis del gel al soporte sólido membrana NC o membrana PVDF. Es una tecnología de detección de proteínas que utiliza anticuerpos específicos para detectar un antígeno específico. El principio básico es utilizar anticuerpos específicos para desarrollar color en células o tejidos biológicos procesados por. Electroforesis en gel El método experimental es ampliamente utilizado y se utiliza comúnmente para la detección de proteínas. Para ideas experimentales, consulte la referencia [7]
Materiales experimentales
Frescos y congelados. células o tejidos
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es un método que utiliza la combinación específica de antígenos y anticuerpos para detectar cualitativa y cuantitativamente respuestas inmunes. El principio básico es unir el antígeno o anticuerpo al. superficie de un soporte sólido para mantener su actividad inmune.
El antígeno o anticuerpo se une a la enzima para formar un antígeno o anticuerpo marcado con enzima, que conserva su actividad inmunológica y su actividad enzimática. Durante el proceso de medición, la muestra a analizar y el antígeno o anticuerpo marcado con enzima reaccionan con el antígeno o anticuerpo en la superficie del soporte sólido según diferentes pasos. El complejo antígeno-anticuerpo formado sobre el soporte sólido se separa de otras sustancias mediante lavado, y la cantidad de enzima finalmente unida al soporte sólido es proporcional a la cantidad de sustancia a detectar en la muestra. Después de agregar el sustrato para la reacción enzimática, la enzima cataliza el sustrato en un producto coloreado. La cantidad del producto está directamente relacionada con la cantidad de sustancia que se va a detectar en la muestra. Por lo tanto, se puede realizar un análisis cualitativo o cuantitativo. realizado en función de la profundidad de la reacción del color. Para ideas experimentales, consulte la referencia [8].
Materiales experimentales
Células o tejidos frescos o congelados
La inmunohistoquímica (IHC) también se llama inmunocitoquímica. Aplica principios de inmunología e histoquímica para detectar niveles de proteínas en secciones de tejido. Utiliza anticuerpos (o antígenos) específicos marcados para detectar la distribución de antígenos (o anticuerpos) en tejidos y células in situ, detecta los antígenos (o anticuerpos) diana correspondientes y realiza análisis de localización, cualitativos y cuantitativos. Según la naturaleza del marcador, la tecnología de detección se puede dividir en tecnología de inmunofluorescencia, tecnología de inmunoenzimas, tecnología de inmunometales y radioinmunoensayo. En el experimento se utilizaron ampliamente la tecnología de inmunofluorescencia y la tecnología de inmunoenzimas. Para ideas experimentales, consulte la referencia [9].
Materiales experimentales
Tejidos incluidos en parafina, muestras de células y secciones de tejido congelado
3. ¿Experimento de verificación de marcadores metabolómicos
? Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS): la cromatografía de gases utiliza los diferentes coeficientes de distribución de diferentes sustancias en la fase estacionaria y la fase móvil para hacer que diferentes compuestos fluyan fuera de la columna cromatográfica en diferentes momentos, logrando así el propósito de separar compuestos. . La espectrometría de masas utiliza los patrones de movimiento de partículas cargadas en un campo magnético o campo eléctrico para realizar análisis de separación basados en la relación masa-carga (m/z) de partículas cargadas para determinar la masa de iones y la distribución de intensidad. Puede proporcionar información sobre el peso molecular, la composición elemental, la fórmula molecular y la estructura molecular del compuesto, y tiene las características de especificidad cualitativa, alta sensibilidad y detección rápida. Para ideas experimentales, consulte la referencia [10].
Materiales experimentales
¿Compuestos de pequeño peso molecular, volátiles, térmicamente estables y vaporizables
? Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS): tiene las ventajas de un amplio rango de análisis, una gran capacidad de separación, resultados de análisis cualitativos confiables, un límite de detección bajo, un tiempo de análisis rápido y un alto grado de automatización. Utiliza cromatografía líquida como sistema de separación y espectrometría de masas como sistema de detección. La muestra se separa de la fase móvil en la parte del espectrómetro de masas. Después de la ionización, el analizador de masas del espectrómetro de masas separa los fragmentos de iones y el detector obtiene el espectro de masas. Para ideas experimentales, consulte la referencia [11].
Materiales experimentales
No volátiles, polarizables, térmicamente inestables y macromoléculas (proteínas, péptidos, polímeros, etc.)
Experimento de verificación de marcas de aprendizaje del Transcriptoma.
1.? Validación de expresión
QRT PCR (ver Genómica) y Northern blotting.
La transferencia Northern se utiliza para detectar y cuantificar si una muestra contiene el producto de transcripción (ARNm) de un gen. El principio es realizar electroforesis en gel de agarosa en la muestra de ARN que se va a analizar en condiciones desnaturalizantes, luego transferir la posición en el gel a una membrana de nitrocelulosa o membrana de nailon, fijarla y luego sondearla con ARN marcado con isótopos u otros marcadores. Reacción de la aguja. La literatura sobre aplicaciones es escasa. Para ideas experimentales, consulte la referencia [12].
Materiales experimentales
Muestras de ARN total o muestras de ARNm (el ARN se degrada fácilmente, por lo que se debe prestar atención al método y período de almacenamiento)
Sensibilidad: qRT -PCR gt; Northern blot, Especificidad: Northern blot gtQRT-PCR (protocolo experimental anterior).
2.? Interacciones entre ARN y proteínas
Inmunoprecipitación de ARN (RIP): las proteínas de interés de unión a ARN (RBP) se inmunoprecipitan junto con su ARN de unión para identificar los ARN transcritos unidos.
Puede detectarse mediante RT-PCR, microarrays o secuenciación, y es una tecnología basada en anticuerpos que se utiliza para localizar interacciones ARN-proteína in vivo. Para ideas experimentales, consulte la referencia [13].
Materiales experimentales
Células
Desplegado de ARN: el ARN se marca (como el etiquetado de una sonda biológica) y se incuba con una solución de extracción de proteínas citoplasmáticas para formar ARN. -Complejo proteico. Las proteínas se separan mediante SDS-PAGE y finalmente se detectan mediante transferencia Western o espectrometría de masas. Se utiliza para encontrar proteínas que se unen al ARN diana. Para ideas experimentales, consulte la referencia [14].
Materiales experimentales
Proteínas citoplasmáticas
? Además, también se incluye la inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP) [13].
Esto finaliza el intercambio de hoy. Debido a que hay muchas formas de verificar cada conjunto de etiquetas, este problema comparte principalmente soluciones comunes. Espero que pueda tener una comprensión sencilla de los métodos experimentales de cada grupo de marcadores. En función de los mecanismos posteriores de cada grupo, es necesario agregar proliferación celular, migración celular, invasión, experimentos de apoptosis y modelos animales. , la mayoría de ellos son similares. Creo que encontrarán el patrón poco después de leer la literatura relevante~
Finalmente, ¡les deseo a todos un manuscrito SCI galardonado!
Referencia
1.? Liu X, Wang J, Chen M, Liu S, Yu X, Wen F. Identificación de marcadores genéticos de pronóstico para el cáncer de pulmón mediante la combinación de datos de la base de datos GEO y la validación cuantitativa por PCR con transcripción inversa. El objetivo de Onco está ahí. 2019;12:709-720. Publicado el 21 de enero de 2019. doi:10.2147/OTT. S183944
2.? ¿Analizar la distribución bacteriana en tumores y tejidos normales adyacentes en 9 tipos principales de cáncer mediante la secuenciación del exoma TCGA? ¿Revista de biotecnología computacional y estructural? vol.18 631-641. marzo de 2020, doi: 10.1016/j. 2020. 03. 003
3. El lncRNA AK006025 inducido por VIH-1 Nef regula la expresión del gen del grupo de astrocitos CXCL9/10/11 mediante la interacción con CBP/P300. ? Neuroinflamación. 2018;15(1):303. Publicado el 31 de octubre de 2018. doi:10.1186/s 12974-018-1343-x
4.? Xie Kai, Zhang Kai, Kong Jun, etc. El gen del oncotestículo PIWIL1 promueve la proliferación, migración e invasión de células de adenocarcinoma de pulmón. ? Medicina del cáncer. 2018;7(1):157‐166.doi:10.1002/cam 4.1248
5.? La metilación aberrante del homólogo 1 del gen mutL se asocia con un mayor riesgo de cáncer de pulmón de células no pequeñas. ? Análisis de laboratorio clínico. 2018;32(5):e22370. doi:10.1002/jcla.22370?
6.? Los genes GALNT9, BNC1 y CCDC8 con frecuencia están desregulados epigenéticamente en los tumores de mama que metastatizan en el cerebro. ? ¿Epigenética clínica? Volumen 7, 1 57. 27 de mayo. 2015, doi: 10.1186/s 13148-015-0089-x
7.? El nuevo inhibidor de STAT3, napabucasina, inhibe la proliferación, invasión y diferenciación de las células de glioblastoma. ? Clin Cancer Res 2019;38(1):289 Publicado el 5 de julio de 2019. doi:10.1186/s 13046-019-1289-6
8.? El suero CCL20 combinado con IL-17A se utiliza como biomarcador para el diagnóstico temprano y el pronóstico del cáncer colorrectal. ? Revista médica. 2019;17(1):253. Publicado el 6 de agosto de 2019. doi:10.1186/s12967-019-2008-y
9.? Los objetivos genómicos relacionados con la N6-metiladenosina están alterados en el tejido del cáncer de mama y se asocian con una supervivencia deficiente. ? cáncer.
2019;10(22):5447-5459 Publicado el 29 de agosto de 2019. doi: 10.7150/JCA 35053
10.? Chen Hong, Pan Ding, Yang Zhi, Li Li. Tesis de maestría de la Universidad Agrícola de China. ¿RAB23? Muestra el papel de... ¿RAB23? Adenocarcinoma gástrico. ? Ann Transl Med. 2019;7(23):745.doi:10.21037/atm
11.? El análisis de vías integrado basado en ómicas reveló que la red relacionada con la ciclooxigenasa CYP es un objetivo de diagnóstico para el cáncer de mama metastásico triple negativo. ? Clin Cancer Res 2019;38(1):187 Publicado el 9 de mayo de 2019. doi:10.1186/s 13046-019-1187-y
12.? Wang Xiaolin, Shi Weiping, Shi Huichun, etc. La regulación negativa de TRIM65 inhibe la proliferación, migración e invasión de células de cáncer de pulmón: un objetivo para el tratamiento del cáncer de pulmón. ? Oncoobjetivo. 2016;7(49):81527‐81540.doi:10.18632/onco target 13131
13.? WTAP promueve la progresión del carcinoma hepatocelular a través del silenciamiento epigenético de ETS1 dependiente de m6A-HuR. ? Cáncer de mol. 2019;18(1):127. Publicado el 22 de agosto de 2019. doi:10.1186/s 12943-019-1053-8
14.? LncRNA EPB41L4A-AS1 regula la glucólisis y la glutaminolisis mediando la translocación nucleolar de HDAC2. ? EBioMedicina. 2019;41:200‐213.doi:10.1016/j.ebiom 2019.01.035
15.? La transcripción como medio de verificación experimental después de la secuenciación de alto rendimiento (1)