? En la identificación temprana de los genes de la autofagia del tabaco, los autores encontraron que la expresión de los ATG relacionados con la autofagia aumentaba significativamente durante la etapa de germinación del polen y alcanzaba un valor máximo en el polen maduro, lo que sugiere que la autofagia puede estar implicada en el crecimiento y desarrollo normal de las plantas. . Por eso, los autores querían utilizar el tabaco como modelo para explorar si este es el caso.
? Afortunadamente, los autores descubrieron a través de diversos medios que la actividad de la autofagia mejoraba enormemente durante la germinación del polen. Los autofagosomas se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión 30 minutos después de la germinación. Cuando se usó Con A (concanavalina A, que acidifica la vacuola y previene la degradación del autofagosoma), se encontró que los autofagosomas estaban enriquecidos en la vacuola cerca del poro de germinación. El inmunoanálisis utilizando autofagosomas marcados con anticuerpos específicos de ATG8 bajo un microscopio óptico reveló una acumulación puntiforme obvia de autofagosomas en los poros de germinación. RT-QCPR también mostró que la expresión de la mayoría de los genes relacionados con la autofagia estaba regulada al alza 1 hora después de la germinación y luego a la baja, lo que sugiere que la autofagia está involucrada en el proceso de germinación del polen.
? Para demostrar que la autofagia está realmente involucrada en el proceso de germinación del polen, mátalo. Entonces utilizaron el inhibidor de la autofagia 3-MA, que es un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PtdIns3K), para tratar la germinación del polen in vitro. Se descubrió que el polen tratado con inhibidores germinaba menos. Además, el tratamiento inhibidor de la germinación tiene un efecto de dosis (experimento cualitativo). Posteriormente, se usó el anticuerpo ATG8 para marcar los autofagosomas y se descubrió que después de agregar 3-MA, la formación de autofagosomas efectivamente se redujo (aproximadamente 70) (experimento cuantitativo). Hasta ahora, se puede decir que la autofagia está involucrada en el proceso de germinación del polen.
? Para explorar más a fondo el papel de la autofagia en el proceso de germinación del polen, los autores compararon la germinación del polen normal y la germinación del polen tratado con 3-MA. Se descubrió que durante el tratamiento con 3-MA, la unión de los poros de germinación formaba una estructura citoplasmática convexa, que era obviamente diferente de otros citoplasmas. Los autores creen que la actividad autofágica es la principal responsable de la eliminación de esta estructura citoplasmática que sobresale.
? En estudios anteriores se sabía que la actividad de la autofagia está relacionada con genes de la familia ATG, por lo que los autores comenzaron a explorar su mecanismo. Entonces, el autor examinó tres copias individuales de los genes ATG2, ATG5 y ATG7 (no el complejo PtdIns3K) para construir vectores de ARNi. Se descubrió que la regulación negativa de ATG2, ATG5 y ATG7 (en el Apéndice) causó una disminución en la tasa de germinación del polen, que fue similar al fenotipo del tratamiento con 3-MA. Y la regulación negativa de los ATG no conducirá a una disminución de la viabilidad del polen, pero sólo entre 30 y 50 polen pueden germinar.
? Sin duda, el objetivo del próximo trabajo será explorar la relación entre la falla en la germinación del polen causada por los ATG y la autofagia. Al utilizar ATG8 y ATG13 como genes informadores de transferencia Western, se puede observar que los niveles de expresión de ATG8 y ATG13 están regulados negativamente en plantas de ARNi, lo que sugiere que cuando uno de los genes está regulado negativamente, el nivel de autofagia también será reducido. regulado a la baja. La detección por inmunofluorescencia encontró que la cantidad de autofagosomas en plantas de ARNi se redujo significativamente. Para distinguir si la reducción de autofagosomas resultó en una reducción o una degradación rápida, Con A no pudo restaurar el número de autofagosomas a niveles de tipo salvaje, lo que sugiere que los ATG están involucrados en la formación de autofagosomas. Usando el mutante CRISPR atg5. Esto ilustra aún más que, de hecho, existe un problema con la formación de autofagosomas.
? Para explorar más a fondo la relación entre la formación de autofagosomas y ATG, los autores analizaron el grado de obesidad de ATG8, ya que es fundamental para la formación de autofagosomas. Todas las fracciones de membrana se recogieron de polen de WT y ATG-RNAi, y la lipidación de ATG8 se determinó mediante análisis de transferencia Western antes o después del pretratamiento con PLD (fosfolipasa D). Después de SDS-PAGE, la banda migratoria de ATG8-PE generalmente se detectó en la transferencia Western, que fue más rápida que la banda migratoria de G8. Como se puede observar, el tipo salvaje corre más rápido después del tratamiento, lo que demuestra que están lipidados en G8.
Sin embargo, en las plantas ATG-RNAi, el grado de lipidación de ATG cayó a niveles normales. En plantas ATGs-RNAi, también se encontró una capa citoplasmática elevada en el poro de germinación y se cuantificó su área.
Para explorar la relación entre la autofagia y los lípidos en la etapa temprana de la germinación del polen, se utilizó cromatografía líquida-espectrometría de masas para analizar el polen de plantas de tipo salvaje y ATG RNAi. Se identificaron y cuantificaron varios esfingolípidos, fosfolípidos y glicéridos en polen natural y silenciado con ATG. El análisis discriminante de proyección ortogonal (OPLS-DA) de estructuras latentes mostró una clara separación entre las cepas de tipo salvaje y ATG_RNAi, lo que indica diferencias significativas en la composición lipídica de cada cepa ATG RNAi. Luego, se analizaron en detalle los lípidos implicados en la autofagia. El fosfatidilinositol (PI), la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilcolina participan en la formación de autofagosomas. El VPS34 puede fosforilar el PI para formar PtdIns3K durante el proceso de nucleación de los autofagosomas. En plantas de ARNi, el nivel de expresión se reduce considerablemente. Además, los niveles de expresión de PE y fosfatidilcolina, que son necesarios para la nucleación de vesículas y la expansión de fagocitos, respectivamente, también disminuyeron en el polen ATGs_RNAi, acompañado de un aumento en algo de lisosomal y lisofosfatidilcolina.
Además, en los mamíferos, la ceramida exógena (Cer) de los esfingolípidos puede inhibir la absorción de aminoácidos e inducir la expresión de BECN1/Beclin1, el ortólogo mamífero de la levadura VPS30/ATG6, para activar la autofagia. Curiosamente, los niveles de Cer en el polen ATGs_RNAi fueron significativamente más altos que los del tipo salvaje. El fosfolípido cardiolipina (CL) se redistribuye desde el interior de las mitocondrias hacia el exterior de las mitocondrias y es importante para la autofagia de las mitocondrias dañadas. El cloruro se acumuló en niveles más altos en el polen de las plantas de ARNi en comparación con el tipo silvestre. El fosfatidilglicerol (un sustrato importante para la síntesis de CL) también se acumuló en el polen de ATGs_RNAi. Asimismo, los niveles de lisofosfatidilglicerol (el precursor para la síntesis de fosfatidilglicerol) también aumentaron en el polen de ATGs_RNAi en comparación con WT. El triacilglicerol (TAG) es el componente principal de muchos granos de polen de plantas almacenados en liposomas. La inhibición de la autofagia puede provocar un aumento de lípidos en plantas y mamíferos. Por tanto, los autores se centraron en la composición de TAG y diacilglicerol (DAG, un metabolito intermedio en la síntesis de TAG). Se observó una gran acumulación de TAG y DAG en ATGs_RNAi. Curiosamente, una nueva subclase de lípidos anfipáticos, los ácidos grasos omega-hidroxi, también se acumularon en niveles elevados en el polen con deficiencia de autofagia. Los estudios anteriores muestran que los cambios en los componentes de la membrana causados por la autofagia aseguran una germinación normal del polen.
Finalmente, los autores utilizaron espectrometría de masas en tándem (TMT) para realizar análisis de espectrometría de masas cuantitativos para explorar los cambios en la expresión de las proteínas posteriores de ATG2 y ATG5. Entre ellos, 4,3 y 2,8 estaban regulados al alza en la encuesta silenciosa ATG2 y ATG 5, mientras que 2,6 y 2,8 estaban regulados a la baja. Por tanto, los autores creen que la vía de la autofagia juega un papel importante en el proteoma del polen. Además, existe una gran superposición entre arriba y abajo en ATG2_RNAi y ATG5_RNAi, y pueden regular la misma vía. Sin embargo, el análisis GO mostró que ATG2 enriqueció principalmente componentes relacionados con proteínas ribosómicas y ribonucleoproteínas, y ATG5 enriqueció componentes relacionados con peptidasas y proteosomas, lo que indica sus diferencias funcionales. En términos de componentes celulares, podemos encontrar que las proteínas relacionadas con el complejo ATP sintasa de transporte de protones mitocondrial están significativamente reguladas a la baja, y los componentes de la membrana celular están significativamente regulados al alza. En los procesos biológicos, las proteínas reguladas negativamente se enriquecen en la biosíntesis de compuestos nitrogenados celulares y el acoplamiento de la síntesis de ATP y el transporte de protones, mientras que las proteínas reguladas positivamente se enriquecen en la transducción de señales mediada por pequeñas GTPasas. Por tanto, los autores creen que ATG2 y ATG5 afectan principalmente a la germinación del polen a través del ATP mitocondrial y la síntesis de proteínas. Para confirmar este resultado, los autores también identificaron vías enriquecidas y descubrieron que tanto las proteínas reguladas hacia arriba como hacia abajo se clasificaron como vías relacionadas con la fosforilación oxidativa.
Este artículo revela cómo la autofagia participa en el proceso de germinación del polen y revela su impacto sobre los componentes lipídicos y las proteínas posteriores.
Sin embargo, parece redundante que estas proteínas ATG parezcan desempeñar un papel en la germinación del polen, pero cada planta con ARNi tiene un fenotipo, lo que me parece extraño. Sería mejor si pudiéramos hacer mutaciones dobles o triples. Además, ¿cuál es la función de otro ATG cuya expresión cambia durante la germinación del polen? Se requiere más excavación.