Objetivo Explorar los efectos tóxicos del uso combinado de kanamicina y furosemida en la cóclea de cobayas . Métodos A veinticinco cobayas del grupo experimental se les inyectó kanamicina 500 mg/kg por vía intramuscular y furosemida 50 mg/kg por vía intravenosa 2 horas más tarde, y a cuatro cobayas del grupo de control se les inyectó. Al séptimo día después de la administración, se detectó la función auditiva de los cobayas del grupo experimental y del grupo de control utilizando un instrumento de potenciales evocados del tronco encefálico auditivo. La cóclea de cobayas con un umbral superior a 95 dB SPL se observó mediante tinción por inmunofluorescencia y corte convencional, y la cóclea se observó mediante microscopía electrónica de barrido. Resultados El umbral de la prueba ABR de 13 cobayas en el grupo experimental fue superior a 95 dB SPL. Las observaciones de cobayas sordas revelaron que las células ciliadas y las fibras nerviosas estaban significativamente dañadas, especialmente la primera y la segunda cóclea. Conclusión La kanamicina combinada con furosemida puede causar daños graves a las células ciliadas y las fibras nerviosas en cobayas, y es un método rápido y eficaz para establecer un modelo de sordera.
Kanamicina; furosemida; potenciales evocados auditivos del tronco encefálico; histopatología coclear; inmunofluorescencia
Resumen Objetivo Explorar el uso combinado de kanamicina y el diurético de asa furosemida ototoxicidad en cobayas. Métodos: A los conejillos de indias se les inyectó KM por vía intramuscular (500 mg/kg) y, 2 horas más tarde, se les inyectó furosemida (50 mg/kg) por vía intravenosa. Las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR) se registraron el día 7 después de la administración para controlar la audición de los animales. Se observaron cambios inmunohistoquímicos e histopatológicos bajo microscopio óptico y microscopio electrónico de barrido. La monitorización ABR posterior reveló una pérdida auditiva profunda que era bilateral y permanente. El examen histopatológico mostró pérdida de células ciliadas internas y externas en la cóclea basal. El alcance del daño de las fibras nerviosas también está presente en la cóclea basal y depende del tiempo de supervivencia después de una cirugía ensordecedora. Conclusión La aplicación combinada de KA y furosemida puede causar eficazmente una pérdida auditiva profunda en conejillos de indias y es un método ensordecedor eficaz para experimentos agudos con animales.
Palabras clave kanamicina (KM); furosemida; respuesta auditiva del tronco encefálico; histopatología coclear
Aplicación combinada de inyección intramuscular de kanamicina (KM) y La ventaja de establecer un modelo de sordera animal con orina. ácido (EA) es que puede inducir sordera con una sola administración y no estimula la cóclea ni la ventana redonda [1]. La kanamicina es un antibiótico aminoglucósido y se han informado estudios clínicos y experimentales de toxicidad en el oído interno. La furosemida es un diurético de asa. Los estudios experimentales sobre la ototoxicidad de la furosemida han demostrado [2] que la furosemida puede provocar cambios patológicos en las células del borde de la estría vascular. Nuestros experimentos anteriores utilizaron pruebas como la respuesta auditiva del tronco encefálico para demostrar que la función auditiva de los conejillos de indias resultó gravemente dañada tres días después de la combinación de KM y ea [3]. Este estudio utilizó secciones congeladas, tinción con succinato deshidrogenasa (SDH), tinción por inmunofluorescencia y técnicas de microscopía electrónica de barrido para evaluar los efectos tóxicos de la kanamicina combinada con furosemida en la cóclea de cobayas desde la perspectiva de la patomorfología del oído interno.
1Materiales y métodos
1.1 Agrupación de animales
Veintinueve cobayas adultos sanos, blancos, de ojos rojos, con aurículas sensibles, tanto machos como hembras, peso corporal Se dividieron aleatoriamente 250 ~ 300 g (proporcionados por el Centro Experimental de Animales del Hospital General del Ejército Popular de Liberación) en dos grupos, con 25 animales en el grupo experimental y 4 animales en el grupo de control en blanco.
1.2 Medicación animal
Al grupo experimental de cobayas se le inyectó sulfato de kanamicina 500 mg/kg una vez en el músculo femoral medial y se inyectó furosemida 2 horas más tarde: los animales anestesiados fueron Se inyectó en el músculo femoral medial a una velocidad de Mianxin de 0,01 ml/kg, se expuso una vena yugular durante la operación y se inyectó furosemida a 50 mg/kg en 30 segundos [3].
Sulfato de kanamicina: 250000 unidades/ml, producido por Tianjin Pharmaceutical Jiaozuo Co., Ltd., número de lote: 06051531; furosemida: 10 mg/ml, producido por Tianjin Jinyao Amino Acid Co., Ltd. número de lote: 0606191. Sumianxin: 1,5 ml, proporcionado por el Instituto de Investigación en Ganadería de la Universidad de Suministros Militares del EPL. Sus ingredientes principales son haloperidol, metano y ketamina.
1.3 Prueba de umbral de respuesta auditiva del tronco encefálico
Después de tomar el medicamento durante 7 días, los dos grupos de cobayas fueron evaluados bilateralmente utilizando el sistema Smart EP 2.22 de la empresa estadounidense de audición inteligente. sistema auditivo en una habitación blindada e insonorizada. Prueba de umbral ABR. El sonido de estímulo utiliza un tono de ráfaga, el ancho del filtro de paso de banda es de 300 ~ 3000 Hz, el número de superposiciones es de 65438 ± 0024 veces y el tiempo de exploración es de 65438 ± 00 ms. La disposición de los electrodos es la siguiente: la parte superior del cráneo es el electrodo de registro, el oído es el electrodo de referencia y el electrodo de tierra se coloca en la punta de la nariz. Como tonos de estímulo se utilizaron tonos puros cortos a 2 kHz, 4 kHz, 8 kHz y 16 kHz.
1.4 Preparación de la muestra
Después de la decapitación, retire el hueso temporal, abra la burbuja auditiva, taladre un pequeño orificio en la parte superior de la cóclea y abra la ventana ovalada y la ventana redonda en al mismo tiempo; luego use una pajita para agregar fijador de paraformaldehído al 4%. Se vertió en la cóclea a través del pequeño orificio en la punta de la cóclea hasta que el líquido salió por las dos ventanas y luego se sumergió el hueso temporal en el fijador. Las cócleas de 8 cobayas del grupo experimental con un umbral ABR superior a 95 dB SPL y 3 cócleas del grupo de control se tomaron para seccionamiento congelado de rutina. Las cócleas de 14 cobayas del grupo experimental con un umbral ABR superior a 95. dB SPL y 3 cócleas en el grupo de control se sometieron a tinción por inmunofluorescencia. Se prepararon muestras de microscopía electrónica de barrido a partir de las cócleas de 4 cobayas con umbrales ABR superiores a 95 dB SPL en el grupo experimental y de la cóclea de 2 cobayas en el grupo control. el grupo de control.
1.5 Tinción inmunohistoquímica
Las muestras cocleares se lavaron tres veces con solución salina tampón fosfato (PBS) de 0,01 mol/l. Triton-PBS al 0,1% durante tres minutos. Sellar con suero de oveja al 10% (diluido en Triton-PBS al 0,01%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Vierta la solución de sellado de suero de oveja sin lavar. Se añadieron anticuerpo de miosina derivado de conejo y anticuerpo de neurofilamento derivado de ratón (SIGMA Biotechnology Company), se diluyeron con suero de oveja Triton-PBS al 3 % y se congelaron a 4 °C durante la noche. Lavar tres veces con Triton-PBS al 0,1% durante 10 minutos. Agregue anticuerpos secundarios (anticuerpos IgG de cabra anti-conejo y de cabra anti-ratón marcados con colorante fluorescente Alexa Flour 488) e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar tres veces con PBS durante 10 minutos cada una. Disco de sellado anti-quench. Observado mediante escaneo láser * * microscopio de enfoque (LSM Zeiss 510 Meta, Alemania).
1.6 Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido
Después de retirar el tejido coclear, todas las muestras se fijaron con glutaraldehído y tetróxido de osmio, se tiñeron con ácido tánico al 2 % y se deshidrataron con etanol graduado. . Hay un exceso de acetato de isoamilo y la muestra se seca usando un secador de punto crítico HCP-2 y un pulverizador iónico al vacío E-102 producido por Hitachi, y luego se observa y se fotografía con un microscopio electrónico de barrido S-4800.
2 Producción de frutos
2.1 Observación histomorfológica
Debido a diferencias individuales, las cobayas tienen diferente sensibilidad a las drogas. El umbral ABR de 13 cobayas en 25 grupos experimentales fue superior a 95 dB SPL después de 1 semana de medicación. Las observaciones con microscopio electrónico de barrido de la cóclea de estos conejillos de indias gravemente sordos mostraron que los estereocilios de las células ciliadas internas y externas del primer y segundo circuito estaban dispersos y fusionados, e incluso todas las células ciliadas fueron reemplazadas por cicatrices (Figura 1). ). La observación con microscopio óptico de secciones cocleares de cobayas sordas reveló que las células ciliadas cocleares estaban gravemente dañadas, principalmente las células ciliadas externas. El daño a las células ciliadas cocleares en el primer y segundo circuito es más grave que el del tercer y cuarto circuito, y algunos conejillos de indias sufren daños graves. Por lo general, también faltan células ciliadas internas (Fig. 2).
2.2 Observación histológica por inmunofluorescencia
La tinción por inmunofluorescencia se realizó en 5 cobayas (65.438 ± 00 orejas) con umbrales de ABR superiores a 95 dB SPL en diferentes puntos temporales después del tratamiento. Bajo el microscopio de enfoque * * * de escaneo láser, se encontró que, en comparación con el grupo de control normal, excepto los 65,438+0 conejillos de indias a las 65,438+0 semanas después de la administración y los 65,438+ a las 65,438+0 semanas después de la administración, 0El nervio Las fibras en ambos oídos de los cobayas son casi normales. De manera similar al daño a las células ciliadas, el daño a las fibras nerviosas en la primera y segunda circunvolución de la cóclea es más grave que el de la tercera y cuarta circunvolución (Figura 3).
3 Discusión
La ototoxicidad de los antibióticos aminoglucósidos está estrechamente relacionada con los efectos tóxicos de los radicales libres de oxígeno [4]. Los diuréticos de asa pueden provocar intoxicación por la estría vascular y dañar la secreción de líquido linfático. Función[2]. Cuando los dos medicamentos anteriores se usan juntos, los antibióticos aminoglucósidos entran en contacto con la membrana de las células ciliadas del oído interno, lo que aumenta la permeabilidad de las células ciliadas del oído interno, mientras que el diurético de asa ingresa a las células en altas concentraciones y causa daño al cabello. células [5].
1979 Russell et al. [6] aplicaron por primera vez KM y ácido úrico a cobayas. Asakuma et al. [7] estudiaron los efectos de la furosemida y el ácido úrico sobre el potencial de CC de la cóclea de cobaya con y sin sulfato de kanamicina.
Bobbin et al. [8] utilizaron cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para estudiar la liberación inducida por potasio de ácido gamma-aminobutírico (GABA) y otras sustancias de la cóclea de cobaya. Se perfundió la cóclea de cobayas con perilinfa artificial con concentración normal de K+ (5 mmol/L) y alta concentración de K+ (50 mmol/L), incluidos animales normales y el órgano de Corti que había sido lesionado con kanamicina y ácido úrico. por adelantado.
Efecto: el ácido aminobutírico, el ácido 2-aminoetanosulfónico, el ácido glutámico, el ácido aspártico y la glicina fueron significativamente más altos que los del grupo con concentración normal de potasio. En comparación con el grupo normal, la liberación inducida por potasio de GABA, ácido 2-aminoetanosulfónico, ácido glutámico, ácido aspártico y glicina se redujo significativamente en el grupo de destrucción del órgano de Corti. Del análisis de los resultados se cree que la liberación de GABA es coherente con su neurotransmisor en la cóclea.
Raphael et al. [9] estudiaron los cambios estructurales y moleculares en la cóclea de cobaya tras el uso de fármacos ototóxicos. Se descubrió que los filamentos de actina desaparecieron en la capa epidérmica y los estereocilios de las células ciliadas cocleares, y aparecieron estructuras similares a puentes ricas en actina en la zona superior de las células ciliadas moribundas. Dos células de soporte forman una cicatriz en la ubicación de las células ciliadas primarias, y las células de soporte se expanden e invaden el espacio de Nuel y el área donde anteriormente se encontraban las células ciliadas. Las áreas con cicatrices se pueden marcar con citoqueratina. También se descubrió que el sitio final de la degeneración es la punta de la célula ciliada, y la degeneración de las células ciliadas ocurre simultáneamente con la formación de cicatrices. En este estudio, mediante observación con microscopía electrónica de barrido, también encontramos que en la cóclea de cobaya gravemente lesionada, el área epitelial sensorial fue completamente reemplazada por una cicatriz (Figura 1).
Se puede ver en nuestros resultados experimentales anteriores que la sordera en cobayas causada por el uso combinado de KM y furosemida es bilateralmente simétrica. Después de 1 semana de tratamiento, la mitad de los cobayas desarrollarán neurosensorial grave. Daño a los nervios. Sordera sexual[3]. Los estudios patológicos en la cóclea de estos conejillos de indias sordos encontraron que las células ciliadas cocleares estaban gravemente dañadas, principalmente las células ciliadas externas. Las células ciliadas cocleares del primer y segundo circuito estaban más gravemente dañadas que las del tercer y cuarto circuito. La tinción de las fibras nerviosas cocleares mostró que las fibras nerviosas de los conejillos de indias sordos estaban significativamente reducidas, lo que también mostró que el primer y segundo circuito estaban más severamente reducidos que el tercer y cuarto circuito. Para explorar el mecanismo del daño de las células ciliadas causado por KM y furosemida, es posible que las células ciliadas externas tengan una mayor capacidad para absorber fármacos ototóxicos que las células ciliadas internas, y que las células ciliadas externas en la circunvolución basal y la circunvolución parietal tengan diferentes capacidades para absorber. Fármacos ototóxicos. En cuanto a por qué las células ciliadas en diferentes partes tienen diferentes capacidades de absorción de fármacos, se especula que puede estar relacionado con la distribución y actividad de los transportadores de fármacos en la membrana celular [4].
Los experimentos de Dong Minsheng demostraron que después de 6 días de inyección intramuscular continua de KM, las células sensoriales del oído interno fueron dañadas primero, la degeneración de las células de soporte fue significativamente más tardía que la de las células ciliadas y la degeneración de los ganglios espirales y las fibras nerviosas fue incluso posterior. Por lo tanto, se cree que el daño a las células sensoriales en el oído interno es la causa principal del daño auditivo causado por la KM. Nuestros resultados experimentales son consistentes con el daño a las células sensoriales del oído interno, pero descubrimos que después del uso combinado de KM y furosemida, no solo se dañó el epitelio sensorial del oído interno, sino también las fibras del nervio auditivo.
En 2004, Nourski et al. [1] informaron del uso de KM y ácido úrico para establecer un modelo animal de sordera aguda, y observaron la eficacia de este método en experimentos agudos con cobayas, y detectaron problemas auditivos. sensibilidad y estado del nervio auditivo. Para ello, se midieron repetidamente el potencial de acción compuesto evocado acústicamente (ACAP) y el potencial de acción compuesto evocado eléctricamente (ECAP). Los resultados mostraron que en 4 de los 6 cobayas, la amplitud de ACAP cayó a cero dentro de 4 a 6 horas después de la administración de ácido úrico, mientras que en los 2 restantes, ACAP continuó respondiendo 65.438 ± 00 horas después de la administración. Al mismo tiempo, el autor también registró ECAP. A diferencia de ACAP, la amplitud de ECAP fue relativamente constante de un experimento a otro y no demostró cambios consistentes con el tiempo transcurrido desde la administración o los efectos de ACAP. Con base en los resultados de ACAP y ECAP, los autores concluyeron que los fármacos KM y ácido úrico se han dirigido al daño de la función de las células ciliadas sin inhibir significativamente la reactividad del nervio auditivo, lo que parece contradecir algunos de nuestros resultados experimentales. La razón de esta diferencia es que el tiempo de observación después de la administración del fármaco es diferente: el tiempo de observación de Nourski et al. fue dentro de las 10 horas posteriores a la administración del fármaco, mientras que nuestra observación fue dentro de la semana posterior a la administración del fármaco. Es posible que no estén presentes las fibras nerviosas auditivas. dentro de las 10 horas posteriores a la administración del medicamento, se produjeron daños, pero las fibras nerviosas comenzaron a dañarse en 1 semana y las fibras nerviosas se dañaron significativamente después de 3 semanas de medicación.
Referencias
1 Nourski KV, Miller CA, Hu N, et al. Coadministración de kanamicina y ácido etaico como método ensordecedor para experimentos agudos con animales. Ver Resolución, 2004, 187(1-2):131-133.
2 Dong Minsheng, Dong Mingmin, Lou. Avances de la investigación en enfermedades del oído interno. Zhengzhou: Prensa de la Universidad Médica de Henan, 1999: 12-22.
3 Zhang Xi'anfen, Shi Yangming, Hu Yinyan, etc. Estudio sobre la función auditiva coclear de cobayas tras la administración combinada de kanamicina y furosemida. Revista china de ciencias de la rehabilitación del habla y la audición, 2008, 6 (2): 15-20.
4 Ding Dalian, Salvi. Estudios de ototoxicidad de antibióticos aminoglucósidos. Revista China de Otología, 2007, 5 (2): 125-131.
5 Zhang Yamei. Sordera inducida por fármacos. Revista China de Pediatría, 2000, 38 (12): 781-782.
6 Russell Nueva Jersey, Foxco, Brummett RE. Efectos ototóxicos de la interacción entre kanamicina y ácido etanoico. La ultraestructura coclear se correlaciona con el potencial coclear y los niveles de kanamicina. Revista de Otorrinolaringología, 1979, 88 (5-6): 369-381.
7 Asama S, Yuki JB. Efectos de la furosemida y el ácido etánico sobre los potenciales de corriente continua en la cóclea de cobayas normales y tratadas con sulfato de kanamicina. Cirugía otorrinolaringológica de cabeza y cuello, 1980, 88(2): 188-193.
8Spool RP, Zhang Jingli G, Fallon M. El potasio induce la liberación de GABA y otras sustancias en la cóclea de la cobaya. Ver Resolución, 1990, 46(1-2): 83-93.
9Raphael Y, Altschuler Ridge. Cicatrización después de una lesión coclear inducida por fármacos. Escuche Res, 1991, 51(2):173-183.