El método de terminación de cadena didesoxi utiliza el principio de replicación del ADN. El sistema de reacción de secuenciación de Sanger incluye fragmentos de ADN diana, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP), trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTP), cebadores de secuenciación y ADN polimerasa. El núcleo de la reacción de secuenciación es el uso de ddNTP: debido a la falta de grupos 3'-OH, no tienen la capacidad de conectarse con otro dNTP para formar un enlace fosfodiéster. Estos ddNTP se pueden usar para terminar la extensión de. la cadena de ADN. Además, estos ddNTP están vinculados con isótopos radiactivos o grupos de etiquetado fluorescente, por lo que pueden detectarse mediante instrumentos automatizados o sistemas de imágenes en gel.
La tecnología 454 de Roche, la tecnología Solexa/Hiseq de Illumina y la tecnología SOLID de ABI marcan el nacimiento de la tecnología de secuenciación de segunda generación. Entre ellos, el sistema de secuenciación 454 de Roche es la primera plataforma de secuenciación operada comercialmente en tecnología de secuenciación de segunda generación.
Entre ellos, Illumina representa más del 75% del tamaño del mercado, e incluye principalmente a Miseq e Hiseq. A continuación se presenta principalmente su principio de secuenciación PE (Pair End):
Sustantivo:
celda de flujo: el portador/contenedor de la reacción de secuenciación, 1 celda de flujo tiene 8 carriles
carril: el carril paralelo de la reacción de secuenciación, el lugar donde se producen la adición de reactivos, la elución y otros procesos
mosaico: la ubicación de cada escaneo de fluorescencia, que es invisible a simple vista
Secuenciación de extremos pareados: la secuencia puede tener entre cuatrocientos y quinientos pb de longitud, con 120-150 pb medidos en ambos lados
Unión: algunas regiones no detectadas en medio de la secuenciación de extremos pareados
(código de barras): un carril generalmente analiza varias muestras y a cada muestra se le agrega una etiqueta de secuencia específica para distinguir diferentes muestras.
estructura de celda de flujo: un carril contiene dos columnas (franja), cada columna tiene 60 mosaicos, cada mosaico plantará un grupo diferente y cada mosaico se fotografiará 4 veces en un ciclo (cada Base una vez)
Después de la interrupción, aparecerán extremos desiguales y se utilizan enzimas para suavizarlos, por lo que la secuencia actual tiene extremos romos.
Después de completar el llenado, use una enzima para agregar una base A específica al extremo 3'. Después de agregar A, puede usar el principio de emparejamiento complementario y agregar un adaptador. dos partes, una parte es la secuencia del cebador necesaria para la secuenciación y la otra parte es la secuencia del cebador necesaria para la construcción y amplificación de la biblioteca.
Realizar amplificación por PCR para que la concentración de nuestra muestra de ADN sea suficiente para los requisitos de la máquina.
las lecturas1 y las lecturas2 no se superponen.
La celda de flujo es un canal que se utiliza para absorber fragmentos de ADN que fluyen y aquí se realiza la secuenciación. La secuencia que se probará en la biblioteca construida anteriormente se configuró con una cierta concentración de antemano. Al pasar, se unirá fuerte y aleatoriamente al carril bajo la acción de reactivos químicos específicos y se combinará con la secuencia corta anterior. El resultado de la carga es que el carril adsorbe el ADN lavado y puede realizar una amplificación por PCR en puente en la superficie.
Cadena directa de secuenciación de extremos pares:
¿Por qué existe un límite de longitud para la secuenciación de Illumina?
Secuenciador Hiseq2000
El secuenciador está equipado con dos celdas de flujo, denominadas celdas de flujo dual. El Hiseq2500 más clásico puede producir entre 700 y 800 Gb de datos a la vez (Gb aquí es el número de bases de secuenciación, que es diferente del número de Gb de bytes)
Volumen de datos = longitud de lectura de un solo extremo * número de lecturas de un solo extremo * 2 (PE)
Profundidad de secuenciación = tamaño de datos/tamaño del genoma de referencia
Este es un nuevo hito. Marcada por SMRT de PacBio y la tecnología de secuenciación de nanoporos de una sola molécula de Oxford Nanopore Technologies, se denomina tecnología de secuenciación de tercera generación. En comparación con las dos generaciones anteriores, la característica más importante es la secuenciación de una sola molécula. El proceso de secuenciación no requiere amplificación por PCR y la longitud de lectura ultralarga alcanza un promedio de 10 Kb-15 Kb, que es más de 100 veces mayor que la de la segunda. -Tecnología de secuenciación de generación Vale la pena señalar que en el proceso de secuenciación, las longitudes de lectura de estas secuencias ya no son iguales.
1. /p/101c14c3a1d2
2. /p/20702684
3. /s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg
4. /s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A