Este artículo analiza los principios, características y casos exitosos de varios métodos domésticos comunes de mejoramiento por mutación física y química en los últimos años, proporcionando una base para el mejoramiento por mutación microbiana. Este artículo revisa el progreso de la aplicación de la tecnología de la información en el mejoramiento de cepas de enzimas, antibióticos, aminoácidos, vitaminas y pesticidas de alto rendimiento. Se analizan las perspectivas de aplicación de esta tecnología combinada con la tecnología de haces de iones y la tecnología espacial en la cría de cepas microbianas.
Palabras clave: mutación; reproducción microbiana; avances de aplicaciones; perspectivas
Los microorganismos están estrechamente relacionados con la industria cervecera, la industria alimentaria, la industria de productos biológicos, etc. La calidad de sus cepas está directamente relacionada con la calidad de muchos productos industriales e incluso afecta la calidad de la vida diaria de las personas, por lo que es necesario cultivar cepas microbianas de alta calidad y alto rendimiento. El propósito del mejoramiento microbiano es guiar el desarrollo de rutas metabólicas biosintéticas en la dirección deseada, o promover la recombinación de genes intracelulares para optimizar rasgos genéticos y acumular artificialmente algunos metabolitos para obtener las cepas deseadas con alto rendimiento, alta calidad y bajo costo. consumo. La cría por mutaciones, como uno de estos métodos, se ha utilizado ampliamente. En la actualidad, la comunidad de cría de microbios nacionales todavía utiliza principalmente factores físicos y químicos convencionales y otros métodos de mutagénesis. Además, la tecnología de mutagénesis de protoplastos se ha utilizado ampliamente en la selección de enzimas, antibióticos, aminoácidos, vitaminas y otras cepas, y ha logrado muchos resultados importantes.
1. Crianza por mutación
1.1 Mutación física
1.1.1 Irradiación ultravioleta
La irradiación ultravioleta es un incentivo físico de uso común. El método de mutación también es una herramienta muy útil para inducir mutaciones microbianas. El pico máximo de absorción de purina y pirimidina en el ADN y el ARN es de 260 nm, por lo que la luz ultravioleta a 260 nm es el agente letal más eficaz. Hay muchas explicaciones para el papel de la luz ultravioleta, pero la función definitiva es hacer que las moléculas de ADN formen dímeros de pirimidina [1]. La formación de dímeros bloquea el emparejamiento normal entre bases y, por tanto, puede provocar mutaciones e incluso la muerte [2].
La mutagénesis por irradiación ultravioleta es sencilla y económica, se puede lograr en condiciones generales de laboratorio y tiene una alta probabilidad de mutación positiva. Este método se utiliza principalmente para la mutagénesis de cepas de levadura.
1.1.2 Radiaciones ionizantes
Los rayos γ son uno de los rayos ionizantes más utilizados en biología ionizante. Tiene alta energía y puede producir ionización, que puede cambiar directa o indirectamente la estructura del ADN. El impacto directo es que se pueden oxidar las bases de la desoxirribosa, o los enlaces químicos de la desoxirribosa y los enlaces químicos del azúcar y el fosfato. El efecto indirecto es que el agua o las moléculas orgánicas pueden generar radicales libres, que pueden sufrir cambios químicos con las moléculas de soluto en las células, lo que lleva a la eliminación y daño del ADN [2].
Además de los rayos gamma, las radiaciones ionizantes también incluyen los rayos X, los rayos beta y los neutrones rápidos. La radiación ionizante tiene ciertas limitaciones, altos requisitos operativos y ciertos riesgos. Generalmente se usa en procesos de reproducción de mutaciones donde no se pueden usar otros mutágenos.
1.1.3 Implantación de iones
La implantación de iones es una tecnología de alta tecnología que surgió a principios de los años 80. Se utiliza principalmente para la modificación de superficies de materiales metálicos. Se ha utilizado gradualmente en el mejoramiento de cultivos desde 1986, y el mejoramiento microbiano se ha introducido gradualmente en los últimos años [3].
Durante el proceso de implantación de iones, las biomoléculas absorben energía y provocan complejos cambios físicos y químicos. Los productos intermedios de estos cambios son varios radicales libres activos. Estos radicales libres pueden causar daño a otras moléculas biológicas normales, dañar mutaciones cromosómicas y cadenas de ADN en las células, y también pueden dañar el ADN plasmídico. Dado que el rango de inyección de iones es controlable, con el desarrollo de la tecnología de microhaces y la tecnología de posicionamiento preciso, la mutagénesis de posicionamiento será posible [4].
La implantación de iones para la reproducción de mutaciones microbianas es difícil de lograr en condiciones generales de laboratorio y actualmente se utiliza en relativamente pocas aplicaciones.
1.1.4 Láser
El láser es un flujo cuántico de luz, también conocido como partículas ópticas. La radiación láser puede afectar directa o indirectamente a los organismos mediante la aplicación integral de efectos de luz, calor, presión y campos electromagnéticos, provocando efectos de aberración cromosómica, activación o inactivación de enzimas, división celular y cambios en las actividades metabólicas celulares. Una vez que los cuantos de luz actúan sobre cualquier sustancia del contenido celular, pueden causar variaciones en las características citológicas y genéticas de los organismos biológicos. Los diferentes tipos de organismos biológicos irradiados con láser muestran diferentes cambios citológicos y genéticos [5].
Como método de reproducción, el láser tiene las ventajas de un funcionamiento sencillo y un uso seguro. En los últimos años, se han logrado muchos avances en la reproducción microbiana.
1.1.5 Microondas
La radiación de microondas es un tipo de radiación electromagnética de baja energía que tiene fuertes efectos biológicos en el rango de frecuencia de 300MHz ~ 300GHz y tiene efectos térmicos y no térmicos. efectos sobre los organismos vivos. Su efecto térmico significa que puede provocar aumentos locales de temperatura en los organismos. Por tanto, provocar reacciones fisiológicas y bioquímicas; los efectos no térmicos se refieren a diversas reacciones fisiológicas y bioquímicas que no tienen nada que ver con la temperatura bajo la acción de las microondas. Bajo el efecto combinado de estos dos efectos, los organismos producirán una serie de efectos de mutación [6].
Por lo tanto, las microondas también se han utilizado para el mejoramiento por mutaciones en muchos campos, como el mejoramiento de cultivos, la cría de animales y el mejoramiento microbiano industrial, y han logrado ciertos resultados.
1.1.6 Mejoramiento espacial
El mejoramiento espacial, también conocido como mejoramiento por mutación espacial, es el uso de globos de gran altitud, satélites retornables, naves espaciales y otras naves espaciales para transferir semillas de cultivos. tejidos, órganos o vida Es una nueva tecnología de cultivo en la que los individuos son transportados al espacio, utilizan el entorno especial del espacio para mutar genes biológicos y luego regresan a la tierra para reproducir y cultivar nuevas variedades y nuevos materiales. Los factores ambientales espaciales incluyen principalmente la microgravedad, la radiación espacial, el campo magnético alterno, el entorno de ultravacío y otros factores mutagénicos. La interacción de estos factores daña el material genético en los sistemas biológicos, provocando mutaciones, aberraciones cromosómicas, inactivación celular, anomalías del desarrollo y otros fenómenos biológicos.
En comparación con otros métodos de reproducción, la reproducción aeroespacial es una combinación orgánica de tecnología aeroespacial y tecnología de reproducción microbiana. Tiene un alto contenido técnico y un alto costo, y es difícil de lograr por un solo investigador científico o por una investigación científica general. unidad. Sólo puede ser completado por el país junto con la tecnología aeroespacial.
2.1 Mutación química
2.1.1 Agente alquilante
Los agentes alquilantes pueden reaccionar con una o varias bases de ácido nucleico, provocando replicación del ADN y cambios genéticos. en el emparejamiento de bases durante el proceso. Los agentes alquilantes comúnmente utilizados incluyen metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina, etilenimina, sulfato de dietilo, etc.
El metanosulfonato de etilo (EMS) es el agente alquilante más utilizado y tiene una alta tasa de mutagenicidad. Las mutaciones inducidas son en su mayoría mutaciones puntuales, que son altamente cancerígenas y volátiles. El tiosulfato de sodio al 5% puede usarse como terminador y desintoxicante.
La N-Metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) es un supermutágeno muy utilizado, pero tiene cierta toxicidad, por lo que se debe tener cuidado durante su funcionamiento. En condiciones alcalinas, el NTG forma diazometano (CH2N2), que es una de las principales causas de muerte y mutación. Su efecto puede deberse a la alquilación del ADN y del CH2N2 [2].
El sulfato de dietilo (DMS) también se utiliza habitualmente, pero debido a su fuerte toxicidad, rara vez se utiliza en la actualidad. La etilenimina se produce en pequeñas cantidades y es difícil de comprar. La concentración de uso es del 0,0001% al 0,1%, lo que es altamente cancerígeno y requiere una solución tampón.
2.1.2 Análogos de bases
La estructura molecular de los análogos de bases es similar a las bases naturales y pueden integrarse en moléculas de ADN, provocando desajustes y desajustes durante la replicación del ADN. , reorganización funcional de proteínas y cambios fenotípicos. Estas sustancias son relativamente menos tóxicas, pero tienen una tasa de mutación negativa más alta y, a menudo, es difícil obtener buenos mutantes. Los principales son el 5-fluorouracilo (5-FU), el 5-bromouracilo (5-BU) y la 6-cloropurina. Cheng et al. [25] utilizaron 5-BU para mutagenizar células de bacterias productoras de pigmentos (Mycobacterium T17-2-39), y la biomasa promedio aumentó en un 22,5%.
2.1.3 Compuestos inorgánicos
El efecto mutagénico es medio y el riesgo es bajo. El cloruro de litio se usa comúnmente como cristal blanco. Cuando se usa, se prepara en una solución del 0,1% al 0,5%. También se puede agregar directamente al medio de cultivo sólido de mutagénesis durante 30 minutos a 2 días. El nitrito se descompone fácilmente, así que úsalo ahora. El nitrito de sodio se prepara comúnmente a partir de nitrito de sodio y ácido clorhídrico. La concentración de nitrito de sodio es de 0,01 a 0,1 mol/L. Cuando se utiliza, se puede agregar ácido clorhídrico de la misma concentración y volumen.
2.1.4 Otros
El agente reductor clorhidrato de hidroxilamina actúa sobre C para cambiar G-C en A-T. También se usa comúnmente. La concentración es de 0,1% ~ 0,5% y el tiempo de acción. son 60 minutos.
Además, durante la mutagénesis se utilizan dos o más factores mutagénicos juntos, o se utiliza el mismo factor mutagénico repetidamente para conseguir mejores resultados. Gu et al. [7] utilizaron Corynebacterium glutamicum-13761 como cepa inicial y obtuvieron una cepa productora de L-histidina mediante DMS y mutagénesis repetida.
2. Mutágenos
2.1 Selección de mutantes
Al seleccionar mutágenos, es necesario prestar atención a la especificidad de los mutágenos, es decir, un mutágeno mutagénico. Los agentes o tratamientos mutagénicos mutan preferentemente ciertas partes del genoma, mientras que otras partes mutan rara vez, si es que lo hacen. Aunque la base molecular de la especificidad mutágena es menos clara, y aunque las vías de reparación relacionadas ciertamente influyen en ella, la relación entre ellas no es tan simple, y otros factores, incluidas las condiciones ambientales del tratamiento de mutagenización, también afectan el tipo de mutación.
A los genetistas industriales les resulta difícil predecir con precisión qué mutaciones moleculares serán necesarias para mejorar una cepa determinada. Por lo tanto, para generar tantos tipos de mutantes como sea posible, el enfoque más apropiado es emplear varios tipos complementarios de tratamientos de mutación. Far-UVC es sin duda el mutágeno más adecuado y parece inducir todos los tipos de daño conocidos. También es fácil tomar precauciones efectivas y seguras. Entre los mutágenos químicos, los reactivos líquidos son más fáciles de manipular de forma segura que los reactivos en polvo. Otra desventaja es que tiende a producir grupos de mutaciones estrechamente relacionadas, aunque este efecto puede ser una ventaja en algunos sistemas. Por último, hay que reconocer que determinadas cepas pueden no ser mutagenizadas por determinados mutágenos. Por supuesto, esto puede verificarse fácilmente midiendo la dinámica mutacional de mutantes fácilmente detectables, como los mutantes resistentes a los medicamentos o los revertidos prototróficos. [8]
2.2 La dosis de mutágeno
A partir del mejor efecto del cribado aleatorio, la mejor dosis de mutágeno se obtiene en la población superviviente utilizada para el cribado. La mayor proporción de mutantes es deseado ya que esto hará que sea menos laborioso durante la etapa de determinación de la potencia.
Por lo tanto, antes de mejorar la cepa, para determinar la dosis óptima de mutágenos y sentar las bases para la tecnología de mejora de la mutagénesis, generalmente es aconsejable determinar la mutagenicidad de diferentes mutágenos cuando se trata de diferentes dinámicas de cambio. . Las mutaciones de unidades altas por sí solas a veces impiden la determinación de la dosis óptima porque dichas mutaciones son difíciles de detectar. Sin embargo, si se utilizan marcadores fáciles de detectar, como los marcadores de resistencia, aún se puede proporcionar información valiosa siempre que se estimen las limitaciones del método. [9]
3. Progresos en la aplicación de la mutagénesis de protoplastos en la cría microbiana industrial.
3.1 Aplicación en el mejoramiento de cepas enzimáticas
Las enzimas son proteínas catalíticas producidas por organismos biológicos y son elementos esenciales en todos los procesos metabólicos. Se utilizó la tecnología de mutagénesis de protoplastos para mutar cepas productoras de enzimas y se obtuvieron muchas cepas de alto rendimiento.
Hu Jie et al. [10] realizaron UV-cloruro de litio, N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidina (N-método-N′-nitro-N-nitroguanidina, Nt. Ocho). Se seleccionaron cepas mutantes con alta producción de proteasa neutra, siendo la mayor producción de enzimas 1162 veces mayor que la de la cepa original, lo que proporciona una excelente biblioteca candidata para futuras fusiones celulares y recombinación del genoma.
3.2 Aplicación de la producción de antibióticos. cría de cepas
Los antibióticos son metabolitos secundarios de las células microbianas. Actualmente, la fermentación microbiana se utiliza principalmente para la biosíntesis porque la producción de cepas de producción está restringida por la regulación metabólica de múltiples pasos, también es difícil criar cepas de alta calidad. La mutagénesis de protoplastos, como tecnología de mutagénesis, se ha utilizado ampliamente en la cría de cepas de antibióticos de alto rendimiento.
Zhu et al [11] estudiaron los protoplastos de Streptomyces cerevisiae después de la mutagénesis ultravioleta. -Se obtuvo una cepa mutante de alto rendimiento con un rendimiento de micina prístina de 1159 g/l, que fue 10165438 veces mayor que la cepa original.
3.3 Aplicación en aminoácidos, disolventes de producción y mejoramiento de ácidos orgánicos
El aminoácido es la unidad básica de la proteína. La proteína es un polímero biológicamente funcional ampliamente utilizado en alimentos, piensos, medicinas, industrias químicas, agricultura y otras industrias. Por lo tanto, el método principal es la cría. Las cepas de alto rendimiento son una dirección importante para el desarrollo de la industria de los aminoácidos.
La producción de disolventes y ácidos orgánicos son metabolitos primarios de los microorganismos. La tecnología de mutagénesis de Protoplast se utiliza en la producción de disolventes y ácidos orgánicos. También se han logrado resultados en la cría de cepas biológicas.
3.4 Aplicación de la cría de cepas biológicas
Las vitaminas son necesarias para mantener las actividades de vida humana y animal, pero no pueden serlo. sintetizados por sí mismos. La materia orgánica juega un papel importante en el crecimiento, el metabolismo y el desarrollo. Han et al. realizaron un tratamiento con láser en protoplastos de Penicillium PT95 y seleccionaron una cepa mutante L05 con biomasa esclerocial y contenido de carotenoides significativamente mayores.
La producción de esclerocios del mutante aumentó en un 98,6%, el contenido de carotenoides en los esclerocios aumentó en un 28,3% y la producción de carotenoides aumentó en un 154,0%.
3.5 Aplicación de la cría de insectos
Bacillus thuringiensis es un pesticida microbiano bacteriano seleccionado de la naturaleza y se utiliza principalmente para controlar plagas agrícolas y forestales. Wang Leehom et al. [12] utilizaron el método de mutagénesis compuesta UV-LiCl para mutar los protoplastos NU-2 de Bacillus thuringiensis. El período de fermentación de los mutantes seleccionados se acortó de 44 h a 40,3 h y el contenido de proteína cristalina aumentó en un 10,03 %.
4. Mirando hacia el futuro
En los últimos años, con la aparición de nuevas fuentes de mutagénesis, la aplicación de la tecnología de mutagénesis de protoplastos también logrará nuevos avances. Como nueva fuente de mutagénesis, el haz de iones tiene su mecanismo de acción único [13], lo que hace que la mutagénesis por haz de iones tenga las ventajas de un amplio espectro de mutagénesis, un gran rango de variación y una alta tasa de mutagénesis. Su aplicación también ha logrado muchos resultados importantes, especialmente el éxito de la implantación de iones en el cultivo de cepas de VC, lo que ha añadido vitalidad a la industria de Vc de mi país. Las cepas microbianas transportadas en el espacio pueden producir mutaciones genéticas raras en un corto período de tiempo mediante la transformación de factores ambientales espaciales integrales como la microgravedad, la radiación espacial y el ultravacío. La reproducción microbiana es un campo de aplicación importante de la reproducción de tecnología espacial. Se han obtenido algunos resultados prometedores utilizando la tecnología espacial para aumentar la producción de ciertos antibióticos y estudiar preparaciones enzimáticas. Combinando la implantación de iones, la tecnología espacial y la tecnología de protoplastos microbianos, la tecnología de mutagénesis de protoplastos microbianos tendrá perspectivas de aplicación más amplias.
5. Conclusión
Con el rápido desarrollo de la genética y la biología molecular, se han aplicado muchas tecnologías nuevas y complejas al mejoramiento de cepas, como la tecnología de mejoramiento por fusión de protoplastos y la tecnología de mejoramiento por ingeniería genética. , pero la tecnología de reproducción por mutaciones sigue siendo un medio importante y eficaz para mejorar la productividad de las cepas. Su tasa de mutación positiva es relativamente alta y se pueden obtener muchos mutantes excelentes y nuevos tipos de genes beneficiosos. Por otro lado, la reproducción por mutaciones tiene un cierto grado de ceguera y aleatoriedad. En aplicaciones prácticas, los investigadores deben elegir métodos de mutagénesis apropiados en función de condiciones específicas, como cepas iniciales y condiciones de laboratorio. Nuestro laboratorio utiliza un método que combina factores físicos y químicos para realizar mutagénesis compuesta en una variedad de cepas de levadura y ha obtenido cepas ideales. Además, también estamos intentando realizar mutagénesis múltiple utilizando múltiples factores mutagénicos para obtener una cepa más ideal.
Referencias:
[[1] Madigan, MIT, Martin Coy, MIT (EE.UU.). m (Estados Unidos), Parker, j (Estados Unidos). Microbiología[M]. Beijing: Science Press, 2001:390.
Cao Yousheng, Liu. Microbiología industrial moderna[M]. Changsha: Prensa de ciencia y tecnología de Hunan, 1998.
Chen Yiguang, Li Minggang, Xu Lihua, et al. Nuevos métodos de mutagénesis física y el progreso de su aplicación en el mejoramiento de mutaciones microbianas [J]. .
Yu Zengliang. Efectos biológicos de la implantación de iones y progreso en la investigación sobre mejoramiento [J]. Journal of Anhui Agriculture College, 1991, 18 (4): 251-257.
Hu Weihong. Descripción general de la irradiación con láser de microorganismos [J]. Journal of Laser Biology, 1999, 8(1):66-69.
[6] Lixiviación WM. Efectos genéticos, de crecimiento y reproductivos de la radiación de microondas [J]. Bovine NYAcademicMedicine, 1980, 55(2):249-257.
Gu Huazheng. Crianza de bacterias productoras de L-histidina [J]. Journal of Infinite Light Industry College, 2002, 21(5): 533-535.
Shi Qiaoqin, Wu Songgang. Mejoramiento microbiano industrial (segunda edición) [M]. Beijing: Science Press, 2003:1-4, 76-78.
Dai Sifa, Li Guanhong, Wu. Progreso de la investigación en la tecnología moderna de reproducción microbiana industrial. Journal of Microbiology, junio de 2000, volumen 20, número 2.
[10] Hu Jie, Li Pan, Luo Lixin, et al. 1 Mutagénesis compuesta de protoplastos de esporas de Aspergillus oryzae y reproducción de cepas de proteasa altamente activas [J] 1 Ciencia y tecnología de la industria alimentaria, 2007, 28 (5): 116 ~ 165438.
[11] Zhu, Jin Zhihua 1 Cría por mutación de protoplasto de bacterias prístinas productoras de micina [J] 1 Chinese Journal of Antibiotics, 2006, 31(10): 591 ~ 59466.
[12], Guo 1 Estudio sobre mutagénesis compuesta de protoplastos NU-2 de Bacillus thuringiensis [J] 1 Acta Microbiologica Sinica, 2006, 26 (4): 23 ~ 261.
[ 13 ] Feng Huiyun, Yu Zengliang, Chu Paul[J]1 Ciencia e ingeniería de biomateriales de implantación de iones, 2006, 54(3- 4): 49~1201