La clonación molecular se refiere al proceso de realizar múltiples copias de una secuencia de ADN definida. La clonación se utiliza a menudo para amplificar fragmentos de ADN que contienen genes completos, pero también se puede utilizar para amplificar cualquier secuencia de ADN, como promotores, secuencias no codificantes y ADN fragmentado aleatoriamente. Se utiliza en una variedad de experimentos biológicos y aplicaciones prácticas, desde la huella genética hasta la producción de proteínas a gran escala. A veces el término clon se utiliza incorrectamente para referirse a la ubicación cromosómica de genes asociados con un fenotipo específico, como en la clonación posicional. De hecho, localizar un gen en un cromosoma o región genómica no necesariamente permite el aislamiento o la amplificación de la secuencia genómica asociada.
En la práctica, para amplificar cualquier secuencia de ADN en un organismo vivo, la secuencia debe estar conectada a un origen de replicación, que es una secuencia de ADN capaz de dirigir la reproducción de sí misma y de cualquier secuencia conectada. Sin embargo, se requieren muchas otras características, y existe una variedad de vectores de clonación especializados (pequeños fragmentos de ADN en los que se pueden insertar fragmentos de ADN extraño) que permiten la expresión de proteínas, el etiquetado, la producción de ADN y ARN monocatenario, y muchas otras características. operaciones.
La clonación de cualquier fragmento de ADN implica principalmente cuatro pasos [1]
Romper - romper una cadena de ADN
Unir - conectar los fragmentos de ADN en la forma deseada Pegados secuencialmente juntos
Transfección: insertar fragmentos de ADN recién formados en las células
Cribado/selección: seleccionar células que se transfectan exitosamente con ADN nuevo
Aunque estos pasos son constantes En el proceso de clonación se pueden elegir muchas vías alternativas, que se resumen en estrategias de clonación.
Inicialmente, es necesario aislar el ADN de interés para proporcionar fragmentos de ADN del tamaño adecuado. Posteriormente, los fragmentos amplificados se insertan en vectores (fragmentos de ADN) mediante un procedimiento de ligación. El vector (generalmente circular) se linealiza usando enzimas de restricción y se incuba con el fragmento de interés usando una enzima llamada ADN ligasa en condiciones apropiadas. Después de la ligación, el vector que contiene el inserto de interés se transfecta en células. Se encuentran disponibles muchas técnicas alternativas, como la sensibilización química de las células, la electroporación y la biolística. Finalmente, se cultivan las células transfectadas. Dado que la eficacia del método anterior es particularmente baja, existe la necesidad de identificar células que hayan sido transfectadas exitosamente con una construcción de vector que contenga la secuencia de inserción deseada en la orientación deseada. Los vectores de clonación modernos incluyen marcadores selectivos de resistencia a los antibióticos que permiten el crecimiento únicamente de células en las que se ha transfectado el vector. Además, el vector de clonación puede contener un marcador seleccionable de color que proporciona selección azul/blanco (complementación del factor alfa) en medio X-gal. Sin embargo, estos pasos de selección no garantizan absolutamente que el inserto de ADN esté presente en las células obtenidas. Se requieren más estudios sobre los clones resultantes para confirmar que la clonación fue exitosa. Esto se puede lograr mediante PCR, análisis de fragmentos de restricción y/o secuenciación de ADN.
Clonar una célula significa derivar una población de células a partir de una sola célula. En el caso de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, el proceso es muy sencillo y básicamente sólo requiere la inoculación con el medio de cultivo adecuado. Sin embargo, en el caso de cultivos celulares de organismos multicelulares, la clonación celular es una tarea difícil ya que estas células no crecen fácilmente en medios estándar.
Una técnica de cultivo de tejidos útil para clonar diferentes linajes celulares implica el uso de anillos de clonación (cilindros) [2]. Según esta técnica, se siembra en placas una suspensión de células individuales expuestas a un mutágeno o fármaco utilizado para impulsar la selección en diluciones altas para generar colonias aisladas, cada una derivada de una célula diferente que puede ser un clon; En las primeras etapas de crecimiento, cuando las colonias constan de sólo unas pocas células, coloque anillos de poliestireno estériles (anillos de clonación) que hayan sido empapados en aceite en colonias individuales y agregue una pequeña cantidad de tripsina. Las células clonadas se recogen del anillo y se transfieren a un nuevo recipiente para su posterior crecimiento.
La clonación en la investigación con células madre
Artículo principal: Transferencia nuclear de células somáticas
La transferencia nuclear de células somáticas también se puede utilizar para crear embriones clonados. El propósito más probable es producir embriones para la investigación, específicamente la investigación con células madre. Este proceso también se conoce como "clonación de investigación" o "clonación terapéutica". El objetivo no es crear clones, sino obtener células madre que puedan usarse para estudiar el desarrollo humano y potencialmente tratar enfermedades. Aunque se han creado blastocistos humanos clonados, aún no se han aislado líneas de células madre de la fuente clonal. [3]
Hortícola
En horticultura, el término clon se refiere a todos los descendientes de una sola planta producida por reproducción vegetativa o apomixis. Muchos cultivares de plantas hortícolas son clones, derivados de un solo individuo y reproducidos mediante algún proceso distinto a la reproducción sexual. Por ejemplo, algunas variedades de uva europeas representan clones que se han propagado durante más de dos mil años. Otros ejemplos son las patatas y los plátanos. El injerto puede considerarse clonación en el sentido de que todos los brotes y ramas producidos mediante injerto son genéticamente clones de un solo individuo, pero este tipo particular de clonación aún no ha sido sujeto a escrutinio ético y generalmente se considera una operación completamente diferente.
Muchos árboles, arbustos, enredaderas, helechos y otras plantas herbáceas perennes forman comunidades clonales. Partes de una gran población clonal a menudo se separan del padre, lo que se denomina fragmentación, y forman individuos separados. Algunas plantas también forman semillas de forma asexual, llamadas apomixis, como el diente de león.
Partenogénesis
La derivación clonal ocurre en la naturaleza en algunas especies animales y se conoce como partenogénesis (un organismo se reproduce solo sin pareja). Un ejemplo es la "pequeña hormiga de fuego" (Wasmannia auropunctata), que es originaria de América Central y del Sur pero se ha extendido a muchos ambientes tropicales.
Clonación reproductiva
La clonación reproductiva utiliza la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para crear animales genéticamente idénticos. Este proceso requiere trasplantar el núcleo de una célula adulta de un donante (célula somática) a un óvulo que no tiene núcleo. Si el óvulo comienza a dividirse normalmente, se transfiere al útero de la madre sustituta.
Los clones no son idénticos porque las células somáticas pueden contener mutaciones en su ADN nuclear. Además, las mitocondrias del citoplasma también contienen ADN, y durante la SCNT, este ADN proviene exclusivamente del óvulo donante, por lo que el genoma mitocondrial es diferente al de la célula nuclear donante que lo produjo. Esto puede tener implicaciones importantes para la transferencia nuclear entre especies, ya que la incompatibilidad nuclear-mitocondria puede provocar la muerte.
La oveja Dolly
Artículo principal: La oveja Dolly
Dolly la oveja finlandesa Dorset (1996-07-05–2003-02-14) fue la primer mamífero clonado con éxito a partir de células adultas, aunque el primer clon real fue un renacuajo en 1952[1]. Fue clonada en el Instituto Roslin de Escocia y vivió allí hasta su muerte a la edad de seis años. El 9 de abril de 2003, su espécimen fue colocado en los Museos Reales de Edimburgo, que forman parte de los Museos Nacionales de Escocia.
Dolly es de importancia pública porque el esfuerzo muestra que el material genético de una célula adulta específica, programada para expresar sólo un subconjunto único de sus genes, puede reprogramarse para desarrollar un organismo completamente nuevo. Antes de esta demostración, no había evidencia que respaldara la hipótesis ampliamente difundida de que las células animales diferenciadas podrían dar lugar a organismos completamente nuevos.
El clon de la oveja Dolly tuvo una baja tasa de éxito por óvulo fertilizado; nació después de que se utilizaron 277 óvulos para crear 29 embriones, que produjeron solo tres corderos al nacer, uno de los cuales solo sobrevivió. Tras 9.000 intentos, se han producido 70 terneros, un tercio de los cuales murió; Prometea realizó 328 intentos. Sorprendentemente, aunque el primer clon fue una rana, todavía no se ha clonado ninguna rana adulta a partir de una célula somática de un donante nuclear.
Las primeras afirmaciones fueron que la oveja Dolly tenía una patología similar al envejecimiento acelerado.
Los científicos especularon que la muerte de Dolly en 2003 estaba relacionada con el acortamiento de los telómeros, los complejos de ADN y proteínas que protegen los extremos de los cromosomas lineales. Sin embargo, otros investigadores, incluido Ian Wilmut, que dirigió el equipo que clonó con éxito a Dolly, cree que la muerte prematura de Dolly por una infección respiratoria no estuvo relacionada con un defecto en el proceso de clonación.
Especies clonadas
Más información: Lista de animales que han sido clonados
Las técnicas modernas de clonación, incluida la transferencia nuclear, han tenido éxito en varias especies. Se realizaron pruebas . Experimentos emblemáticos en orden cronológico:
Tadpole: (1952) Muchos científicos han cuestionado si la clonación realmente ocurrió y si experimentos inéditos de otros laboratorios podrían reproducir los resultados reportados. [Cita requerida]
Carpa: (1963) En China, el embriólogo Tong Dizhou clonó un pez. Publicó los hallazgos en una revista científica china que nunca ha sido traducida al inglés. [4]
Ratón: (1986) fue el primer mamífero clonado con éxito. Los científicos soviéticos Chalakhyan, Veplenchev, Sviridova y Nikitin clonaron al ratón "Martha". La investigación fue publicada en la revista Biofizika, Volumen 2, Número 5 (1987). [Aclaración][5]
Ovejas: (1996) a partir de células embrionarias tempranas. Megan y Morag [cita requerida] clonaron ovejas a partir de células embrionarias diferenciadas en junio de 1995 y la oveja Dolly a partir de células somáticas en 1997. [6]
Humanos: (noviembre de 1998) Embrión híbrido producido a partir de células de patas y un óvulo de vaca limpio: no se permite su implantación en el útero, su desarrollo ni su desarrollo debido a cuestiones éticas al nacer. . [cita requerida]
Mono Rhesus: Tetra (hembra, enero de 2000) división embrionaria [7][aclaración]
Gall: (2001) fue el primer clon de una especie en peligro de extinción. [8]
Bovinos: Alfa y Beta (macho, 2001) y (2005) Brasil [9]
Gatos: Gato clonado "CC" (hembra, 2001), Xiaoni John Mule, nacido en 2004, fue el primer gato clonado con fines comerciales [cita requerida]
Mule: una joya de Idaho, John Mule nació el 4 de mayo de 2003 y fue el primer miembro de la familia de los caballos. clon. [Cita requerida]
Caballo: Prometi, una yegua Hafling nacida el 28 de mayo de 2003, es el primer caballo clonado. [Cita requerida]
Clonación humana
Artículo principal: Clonación humana
La clonación humana es la copia genéticamente idéntica de un ser humano existente o preexistente. Este término se utiliza comúnmente para referirse a clones artificiales; los clones en forma de gemelos idénticos son comunes y su clonación se produce durante la reproducción natural. Hay dos tipos de clonación humana que comúnmente se discuten: la clonación terapéutica y la clonación reproductiva. La clonación terapéutica implica la clonación de células de adultos para uso médico y es un área activa de investigación, mientras que la clonación reproductiva implica la creación de clones humanos. Este tipo de clonación reproductiva aún no se ha realizado y es ilegal en muchos países. El tercer tipo de clonación se llama clonación de reemplazo, una posibilidad teórica que es una combinación de clonación terapéutica y reproductiva. La clonación de reemplazo implica reemplazar un cuerpo gravemente dañado, defectuoso o defectuoso con un clon, seguido del trasplante de todo o parte del cerebro.
La clonación humana en todas sus formas es controvertida. Muchos piden que se detenga todo progreso en la clonación humana. Algunas personas y grupos se oponen a la clonación terapéutica, pero la mayoría de las organizaciones científicas, gubernamentales y religiosas se oponen a la clonación reproductiva. La Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia (AAAS) y otras organizaciones científicas han emitido declaraciones públicas recomendando la prohibición de la clonación humana con fines reproductivos hasta que se resuelvan los problemas de seguridad [11]. La idea de extraer órganos de clones humanos en el futuro plantea serias cuestiones éticas. Algunos han considerado la idea de cultivar órganos a partir de órganos humanos; al hacerlo, se podría establecer un nuevo suministro de órganos sin las implicaciones éticas de la extracción de órganos de humanos.
También se está investigando la idea de cultivar órganos humanos biológicamente aceptables en otros organismos, como cerdos o vacas, y luego trasplantarlos a humanos, una forma de xenotrasplante.
American Cell Technology Company creó el primer clon híbrido humano en noviembre de 1998. [12] Fue creado a partir de una célula de una pierna humana y un óvulo de vaca al que se le extrajo el ADN. Destruido después de 12 días. Debido a que los embriones normales se implantan a los 14 días, el director de ingeniería de tejidos de ACT, el Dr. Robert Lanza, dijo al Daily Mail que los embriones no pueden considerarse humanos antes de los 14 días. Al crear un embrión que, si madura, puede dar lugar a un ser humano completo, según la Ley: "El propósito (de la Ley) es la 'clonación terapéutica', no la 'clonación reproductiva'"
En En enero de 2008, el director científico de Wood y Stemagen en California, Andrew French, anunció que habían creado con éxito los primeros cinco embriones humanos maduros utilizando ADN de células cutáneas adultas, con el objetivo de proporcionar una fuente viable de células madre embrionarias. El Dr. Samuel Wood y un colega donaron células de la piel y su ADN se transfirió a óvulos humanos. No está claro si los embriones resultantes son capaces de seguir desarrollándose, pero el Dr. Wood dijo que si esto fuera posible, utilizar la clonación reproductiva sería poco ético e ilegal. Se destruyeron cinco embriones clonados creados en el laboratorio de Stemagen en La Jolla. [13]