Avances recientes en antibióticos glicosiltransferasas RESUMEN Los antibióticos glucósidos, una categoría de compuestos ampliamente utilizados clínicamente como antibacterianos y anticancerígenos, son catalizados por antibióticos glicosiltransferasas (Gtfs) in vivo. El aglicon correspondiente de Gtfs, a menudo funciona en etapas muy tardías de la biosíntesis de los antibióticos. La posición, el tipo y la cantidad de restos de azúcar incorporados a los antibióticos tienen un gran impacto en su bioactividad. Este artículo proporciona una descripción general de las categorías, funciones y características de los Gtfs. , sus aplicaciones en biosíntesis combinatoria y las perspectivas de investigación.
PALABRAS CLAVE Glicosiltransferasa antibiótica; Glucósidos; Glicosilación
Los glucósidos antibióticos se utilizan principalmente en clínica para aplicaciones antibacterianas y antitumorales. Se han descubierto muchos genes que codifican glicosiltransferasas en el grupo de genes biosintéticos de antibióticos [1], pero se sabe poco sobre la especificidad y el mecanismo catalítico de las glicosiltransferasas de antibióticos (Gtfs). La combinación de grupos de azúcares y diferentes ligandos puede aumentar en gran medida la diversidad estructural de los productos naturales. Funcionalmente, estos componentes de azúcar suelen estar involucrados en el reconocimiento molecular de las células diana y afectan la actividad biológica de los compuestos [2]. En la actualidad, con el uso generalizado de antibióticos, las bacterias resistentes a los medicamentos también aumentan año tras año y existe una necesidad urgente de encontrar nuevos antibióticos para competir con ellas. Aumentar los tipos de antibióticos y cambiar su actividad mediante la glicosilación es un enfoque prometedor. Se espera que explorar el mecanismo de producción de los antibióticos glucósidos y las características catalíticas de las glicosiltransferasas siente las bases para el descubrimiento y modificación de nuevos antibióticos activos.
1 Antibióticos glucósidos
Muchos antibióticos glucósidos sufren durante la biosíntesis una glicosilación estereo y regioselectiva. En esta reacción biológica, las glicosiltransferasas catalizan los grupos de azúcares que en su estructura están unidos a los ligandos en forma. de monosacáridos, disacáridos y cadenas de oligosacáridos para formar glucósidos C?, N? y O? En la vía biosintética de los antibióticos glucósidos, la glicosilación suele ser el último paso de la posmodificación. Por ejemplo, las cadenas de azúcar de vancomicina y teicoplanina se introducen al final de la biosíntesis [3].
Fig.1 Los antibióticos glucósidos C?, N? y O?
Hay dos tipos principales de mecanismos de acción de los antibióticos glucósidos. Uno es mediante la inhibición de la síntesis de peptidoglucanos de bacterias Gram-positivas, como el remox. La ramofilanina[4]; el otro tipo inhibe la actividad de la ADN girasa, como la novobiocina[5].
2 El papel principal de la glicosilación en los antibióticos glucósidos
El papel y la importancia de la glicosilación se reflejan principalmente en los siguientes tres aspectos: En primer lugar, aumenta la solubilidad en agua del compuesto. Los derivados de hexosa se combinan con el antibiótico aglicona para aumentar la hidrofilicidad del antibiótico y facilitar la eficacia del fármaco. Un ejemplo típico es la N?acetilglucosamina (GlcNAc) en el heptapéptido cíclico de teicoplanina y la cadena de manosa en el esqueleto de remoplanina. ; en segundo lugar, facilita la secreción. La manosiltransferasa (manosiltransferasa) en la vía biosintética A40926 reconoce específicamente el manosil?PP?C55 como donante de azúcar, lo que facilita la secreción de antibióticos glicosilados [6]. En tercer lugar, la glicosilación es un mecanismo de autoprotección de las bacterias productoras. Durante la producción de oleandomicina, la glicosiltransferasa OleD glicosila el antibiótico intermedio, provocando que se inactive temporalmente en la célula. Después de que se secreta el antibiótico, la glicosilasa hidroliza el glicosil, dejándolo restaurar la actividad[7]. Este mecanismo es relativamente común entre los antibióticos macrólidos y las enzimas con funciones similares incluyen MgtA [8].
3 Glicosiltransferasa
La glicosiltransferasa cataliza la conexión de azúcares activados a diferentes moléculas receptoras in vivo, como proteínas, ácidos nucleicos, oligosacáridos, lípidos y moléculas pequeñas. Los productos de la glicosilación tienen muchas funciones biológicas. Entre las diferentes familias de Gtfs, existe un tipo de Gtfs relacionado con la biosíntesis de antibióticos. Su función es glicosilar los antibióticos en las últimas etapas de la biosíntesis y regular la actividad de los antibióticos mediante cambios en la posición, tipo y cantidad de azúcares.
Con una investigación en profundidad sobre los grupos de genes biosintéticos de antibióticos, se han aislado más de 100 genes de glicosiltransferasa relacionados con la biosíntesis de antibióticos a partir de actinomicetos. El análisis de secuencia muestra que las proteínas codificadas por estos genes pertenecen a la familia de las glicosiltransferasas. La mayoría de los genes de glicosiltransferasas tienen una región conservada rica en glicina cerca del extremo C, que también está presente en las UDP-glucosil y UDP-glucuronosiltransferasas. Seleccione 119 secuencias representativas de glicosiltransferasa registradas en GenBank, realice un análisis sistemático utilizando el software PAUP 4.0 y construya un árbol filogenético utilizando el método del vecino más cercano (Fig. 2). Los resultados del análisis del árbol evolutivo muestran que la relación genética entre los genes de la glicosiltransferasa no puede inferir con precisión sus funciones biológicas [9]. Por ejemplo, EryCⅢ y MegCⅢ tienen una identidad de 83,4 a nivel de aminoácidos. Al reconocer el mismo ligando, se muestran UrdGT1b y UrdGT1c. alta homología (tienen 91 aminoácidos idénticos y solo unos pocos aminoácidos diferentes dentro de una región de 31 aminoácidos), pero transportan diferentes azúcares hexosas, UrdGT1c transfiere L?rodinosa y UrdGT1b transfiere D?olivosa [10]. No existen diferencias obvias en la secuencia genética y el nivel de aminoácidos de las glicosiltransferasas que catalizan la formación de enlaces glicosídicos C?C, C?N y C?O. Por ejemplo, Asm25 (cataliza C Gtfs formados a partir de glucósidos?N) [9. , 11], UrdGT2 (Gtfs catalizado por la formación de glucósidos C?C en la vía biosintética de udamicina) [12], GtfB (catalizado por C?Gtfs formados por glucósidos)[13].
En el proceso de post-modificación de la vancomicina, la función de la glicosiltransferasa GtfB es transferir el grupo glucosa de la UDP?glucosa al esqueleto de la vancomicina, el estudio de su estructura cristalina demostró que la enzima tiene dos. dominios estructurales, y el surco existente en la región media puede contener la región de unión de UDP?glucosa [13]. La determinación estructural de las glicosiltransferasas proporcionará información sobre su especificidad catalítica.
Las dos características distintivas de Gtfs son: en primer lugar, desempeña un papel final en el proceso de biosíntesis de antibióticos, lo que permite su uso flexible en la biosíntesis combinatoria y aclara la especificidad de su estructura de sustrato. la base para el descubrimiento de nuevos compuestos estructurales y funcionales. En la reacción de transferencia de glicosilo catalizada por Gtfs, el C1 de la hexosa se activa mediante la desfosforilación del nucleósido trifosfato, capturando así el sustrato glicosilo en la posición C1 electrófila y luego se combina con el grupo hidroxilo de la aglicona mediante un ataque nucleofílico. En segundo lugar, la mayoría de las glicosiltransferasas pueden catalizar la unión de la hexosa activada al grupo hidroxilo del sustrato de aglicona para formar glucósidos C?O, con sólo unas pocas excepciones, como los derivados de la rebecamicina[14] y la urdamicina[13]. en el que el grupo azúcar está unido a la aglicona mediante enlaces C?N y C?C. Los compuestos N-glucósidos de ansiotricina amida se aislaron de la fermentación de ansiotricina en cultivo en placa YMG. El grupo de azúcar en su estructura está conectado al esqueleto de aglicona a través del N en el enlace amida [11]. En la biosíntesis de urdamicina, puede ser que el átomo de C nucleofílico y el grupo hidroxilo fenólico estén en la posición orto, lo que resulta en la formación de enlaces glicosídicos C?C [12], pero la glicosiltransferasa que cataliza la formación de C?N y C?C Su especificidad no ha sido estudiada en profundidad.
3.1 Investigación de aplicaciones de Gtfs
(1) La investigación in vivo sobre Gtfs se lleva a cabo principalmente mediante métodos genéticos. Un método consiste en reemplazar la bacteria huésped con genes mediados por plásmidos. su propio gen TDP?desoxihexosa sintasa, los mutantes analizados pueden utilizarse como fábricas de células para la transformación de antibióticos. Estos estudios incluyen la ingeniería de la vía de la daunomicina [15] para la producción de grupos glicosilo epiméricos 4' en la cepa productora de pikromicina S. venezuleae y la cepa productora de urdamicina S. fradiae y antraciclinas con diferentes unidades de azúcar [16,17]. .
Otro método consiste en expresar ectópicamente Gtfs en diferentes huéspedes. Ejemplos de esto incluyen expresar el gen oleGII en el huésped S. erythraea para producir 3?O?rhamnosil?6?DEB y expresar el gen tylM2 para producir. 5?O?desosaminil(tilactona)[18].
La investigación ha demostrado que Gtfs tiene adaptabilidad de sustrato a diferentes moléculas de azúcar. El grupo de investigación de Salas creó un sistema de expresión único que combina los genes de síntesis de glicosilo derivados del grupo de genes biosintéticos de elloramicina Cassette y el gen de glicosiltransferasa elMGT. expresados juntos [19]. Aunque se ha demostrado el amplio espectro de sustratos de muchas glicosiltransferasas, todavía hay muchas publicaciones que informan sobre la existencia de genes de glicosiltransferasas específicos, por ejemplo, UrdGT2 de C. cyanogenus [20] y de S NovM del esferoide NCIMB11891 [21]. Sin duda, a medida que se descubran más genes que codifican Gtfs y se estudien más sus mecanismos de acción, también aumentarán las estrategias y modos de modificación de la glicosilación de antibióticos in vivo. Por lo tanto, el establecimiento de fábricas microbianas diversificadas para producir productos naturales con diferentes modificaciones de glicosilación, como la expresión de policétidos modificados por glicosilación (PK), péptidos no ribosómicos (NRP) y antibióticos híbridos PK/NRP, puede brindar la posibilidad de detectar nuevos compuestos activos. .
(2) Estudios in vitro de Gtfs Los estudios in vitro de Gtfs se basan en Gtfs activos, diversas agliconas y donantes de glicosilo. Dado que el contenido de glicosiltransferasas de antibióticos es muy bajo en el cuerpo y la operación de expresión heteróloga es relativamente simple, los investigadores utilizan principalmente la expresión heteróloga en microorganismos como E. coli o S.lividans [22]. Ha habido varios ejemplos exitosos, como NovM, que se descubrió y clonó por primera vez en S. spheroides y se expresó y purificó en forma activa en E. coli [21]. Es posible producir TDP?D?glucosa mediante síntesis química y catálisis enzimática biológica [23]. Comparativamente hablando, las agliconas son las más fáciles de obtener y su producción puede controlarse mediante la degradación del antibiótico original. Por ejemplo, las agliconas correspondientes se obtienen fácilmente a partir de vancomicina y teicoplanina, respectivamente, y el ácido novobícico puede catalizar la reacción de la novobiocina a partir de ácido. obtenido en. Además, también se pueden obtener diferentes ligandos mediante síntesis total o modificación parcial. Como la síntesis química de derivados de daunomicina, carminomicina (carminomicina) y bleomicina (bleomicina) [23 ~ 25].
4 Aplicación de la glicosiltransferasa en la biosíntesis combinatoria
La aplicación de métodos genéticos para producir nuevos policétidos y péptidos ha atraído cada vez más atención. En la superficie, la biosíntesis recombinante de azúcares es igual de compleja que los compuestos silatados. como policétidos y péptidos, sin embargo, en comparación con la complejidad de los policétidos y péptidos sintetasas, las enzimas que catalizan la producción de desoxiazúcar y sus mecanismos de reacción son relativamente conservadoras, por lo que la síntesis recombinante de compuestos glicosilados es más compleja. ].
El grupo de investigación de Salas en España ha establecido un exitoso sistema de clonación y expresión de genes para producir desoxiazúcar activado. El gen diana se encuentra aguas abajo del operón y puede expresarse en Streptomyces mediante el control del promotor. Integre el gen de la glicosiltransferasa oleGII en Streptomyces albus, introduzca el plásmido que sintetiza L?oleandrose, sintetice la eritronolida B (eritronolida B) e integre el gen de la glicosiltransferasa. Después de elmGT, el plásmido pOLV, que biosintetiza L?olivose, se puede introducir con éxito para producir tetracenomicina C [26, 27].
La estructura de los compuestos de estaurosporina (staurosporina) está compuesta por una molécula de azúcar y una unidad de indolecarbazol heterocíclica. Es difícil de obtener por medios químicos y se expresa en un organismo los genes biosintéticos de la rebecamicina y otras estaurosporinas. Se han aislado e identificado compuestos que producen aproximadamente 30 derivados de estaurosporina [28]. Es difícil cambiar la especificidad de Gtfs mediante métodos genéticos. El grupo de investigación de Salas reemplazó con éxito el indol adherido naturalmente expresando directamente el casete del gen de biosíntesis de glicosilo, el gen Gtfs (staN y staG) y el gen biosintético de la estaurosporina. el grupo carbazol sienta las bases para la aplicación de la glicosiltransferasa en la biosíntesis recombinante, lo que demuestra que la biosíntesis recombinante es más ventajosa que la química medicinal en la producción de nuevos productos de glicosilación [16].
4.1 Utilizar bacterias productoras como fábricas de células
Utilizar microorganismos que produzcan compuestos glucósidos como fábricas de células y eliminarlos insertando marcadores de resistencia a antibióticos o eliminando parte del gen en la región codificante del gen. El mutante introduce un gen de glicosiltransferasa exógeno, lo que le permite sintetizar nuevos antibióticos utilizando moléculas de azúcar activadas intracelulares e intermediarios del metabolismo secundario microbiano. Este método se ha aplicado a muchas cepas de producción como eritromicina [29], plicamicina, urdamicina, metilmicina [29] y pikromicina [30].
Otra estrategia para promover la unión de diferentes unidades de azúcar a ligandos es expresar Gtfs de forma heteróloga en organismos que producen compuestos bioactivos similares. El huésped actúa como una fábrica de células para proporcionar fuentes de azúcar activadas por nucleósidos. El esqueleto del ligando puede ser sintetizado por el huésped, o puede sintetizarse controlando los genes cromosómicos y los genes exógenos del huésped, o puede alimentarse con compuestos. Al expresar el gen gtrE derivado de la bacteria productora de vancomicina A. orientalis en Streptomyces toyocaensis, que no produce el polipéptido glicosil A47934, se formó un nuevo derivado glicosil A47934 [17].
Gtfs transporta diferentes azúcares a átomos de C específicos del esqueleto del ligando, y es más significativo utilizar métodos de ingeniería genética para cambiar la posición de los azúcares en el esqueleto. Esta idea produjo con éxito el fármaco antineoplásico híbrido urdamicina y plicamicina. [30].
4.2 Utilizar bacterias no productoras como fábricas de células
En el experimento de transformación de cepas recombinantes, dado que el huésped no produce el esqueleto del ligando, es necesario integrar un plásmido con un gen biosintético del esqueleto del ligando al huésped o añadiendo ligandos al medio de cultivo para su modificación mediante biotransformación. Las moléculas de azúcar se obtienen mediante la transferencia de uno o más plásmidos que contienen los genes necesarios. Ahora se han desarrollado como una herramienta importante algunos plásmidos que pueden sintetizar diferentes azúcares desoxihexosas [31].
5 Perspectivas de investigación de glicosiltransferasas
Recientemente, se obtuvieron cristales de Gtfs en el sistema biosintético de glicopéptidos y la determinación estructural mostró que este tipo de familia de Gtfs tiene dos ** *Mismo dominio estructural . El azúcar NDP? está unido al extremo C? y la aglicona está unida al extremo N? Esta estructura bipartita se mantiene unida mediante solo dos péptidos, lo que sugiere que es posible mezclar y combinar los dominios respectivos [32, 33]. Por lo tanto, la mezcla de ADN o la evolución dirigida de enzimas relacionadas pueden construir Gtfs aparentemente absurdos, cambiar su especificidad de sustrato para unidades de hexosa y ligandos, aumentar en gran medida la diversidad estructural de los compuestos glucósidos y sentar las bases para la detección de nuevos antibióticos glucósidos activos.
En resumen, es necesario cumplir tres requisitos para estudiar la diversidad de patrones de glicosilación en la biosíntesis.
(1) Establecimiento de una biblioteca de glicosiltransferasas Para producir nuevos glucósidos antibióticos mediante biosíntesis recombinante, se debe establecer una biblioteca de genes de glicosiltransferasas para que se pueda utilizar ampliamente en la industria. A medida que se secuencian más grupos de genes, el número de Gtfs también aumentará año tras año. Se ha descubierto que las regiones de Gtfs con extremos N? o C? mixtos y coincidentes se utilizan para construir sistemas catalíticos híbridos, cambiando el reconocimiento de ligandos y desoxiazúcar. Se pueden encontrar nuevos sitios de unión para unidades de desoxiazúcar específicas [34].
(2) Establecer una biblioteca de compuestos de ligandos. Estos compuestos incluyen estructuras de aminocumarina simples, péptidos no ribosómicos (NRP) y ligandos de policétidos aromatizados [25]. Sin embargo, la glicosilación de C?N, C?C catalizada por enzimas similares aún necesita más investigación.
(3) Establecer una biblioteca compuesta de donadores de azúcar. Los donadores de azúcar deben incluir muchos azúcares activados UDP o TDP y desoxiazúcar. Una vez que el desoxiazúcar natural se une al ligando, le da nueva actividad. La carbamilación del desoxiazúcar ocurre en muchos tipos de compuestos como policétidos (novobiocina), péptidos no ribosómicos (como la teicoplanina) y otros antibióticos, por lo que vale la pena preparar todos los derivados de TDP?D? y TDP?L? 33].