Principios de purificación y cristalización de proteínas El primer cuello de botella para obtener la estructura cristalina de las proteínas es preparar una gran cantidad de proteína purificada (gt; 10 mg), cuya concentración suele ser superior a 10 mg/ml, y en base a esta Detección de las condiciones de cristalización. Utilizando tecnología genética recombinante, se insertan genes específicos en vectores de expresión mediante clonación. Este vector suele tener las características de fácil control. Luego, el vector que porta el gen específico se introduce en una célula bacteriana de rápido crecimiento, como Escherichia coli. Si bien la célula bacteriana crece rápidamente, también produce una gran cantidad de proteína decodificada por el gen en el vector de expresión. En términos generales, cuanto mayor es la pureza de la proteína, más probabilidades hay de que se formen cristales, por lo que los pasos para purificar la proteína se convierten en un factor determinante importante. Después de obtener una solución de proteína de alta pureza, el siguiente paso es cultivar los cristales. La formación de cristales de proteínas es similar a la formación de cristales de otros compuestos. Se producen lentamente en una solución saturada. Las condiciones para el crecimiento de los cristales de cada proteína son diferentes. , como el pH y la precipitación, el tipo de agente, la concentración de iones, la concentración de proteínas, etc., como la velocidad a la que la solución alcanza un estado sobresaturado, la temperatura, etc. y las variables bioquímicas, como los iones metálicos o. los inhibidores necesarios para la proteína, el estado de polimerización de la proteína, etc. El punto eléctrico, etc. son todas condiciones de prueba cuando se cultivan cristales. Hasta el momento, no existe ninguna teoría que pueda predecir las condiciones de cristalización, por lo que es necesario probar continuamente varias combinaciones de soluciones de crecimiento de cristales antes de poder obtener un cristal único perfecto. El cultivo de cristales de proteínas generalmente se logra utilizando el principio del método de difusión de vapor, es decir, se agrega una solución que contiene una alta concentración de proteína (10-50 mg/ml) a un solvente apropiado para reducir lentamente la solubilidad de la proteína. A medida que se acerca a un estado de precipitación espontánea, las moléculas de proteínas formarán cristales en pilas ordenadas. Por ejemplo, disolvemos la proteína en una solución de sulfato de amonio de baja concentración (~1,0 M), la colocamos en un recipiente sellado que contiene una solución de sulfato de amonio de alta concentración (~2,0 M) y aumentamos lentamente la concentración hasta alcanzar el equilibrio de fase gaseosa. La concentración de sulfato de amonio en la solución de proteínas puede lograr el propósito de la cristalización. Los cristales de proteínas no se diferencian significativamente de otros cristales en apariencia, pero dentro de los cristales existen grandes diferencias. En términos generales, además de las moléculas de proteína, los otros espacios de los cristales de proteínas están llenos de una solución acuosa entre aproximadamente el 40 y el 60%. Su contenido líquido no sólo hace que el cristal sea frágil, sino que también tiende a causar irregularidades en la disposición de la red. Aparecen las moléculas de proteína, lo que provoca dificultades en el procesamiento de cristales y dificultad en la recopilación de datos de difracción. Sin embargo, debido al alto contenido de agua, el estado de las moléculas de proteína en el cristal es muy similar al de la solución acuosa. Por lo tanto, la estructura proteica resuelta por el cristal puede considerarse básicamente como la estructura en estado natural.