Electroforesis monodimensional. La combinación de electroforesis bidimensional (2-DE) y espectrometría de masas (MS) es el método de investigación proteómica más común. La electroforesis bidimensional incluye enfoque isoeléctrico (IEF) de primera dimensión y SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio) de segunda dimensión. La electroforesis bidimensional puede proporcionar mapas bidimensionales que contienen información sobre el peso molecular y el punto isoeléctrico
Cromatografía multidimensional bidimensional. En la cromatografía multidimensional, las muestras de proteínas generalmente se digieren en fragmentos de péptidos y luego se separan mediante intercambio iónico y HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) de fase reversa. La HPLC de este método se puede acoplar directamente a la espectrometría de masas, que puede analizar eficazmente proteínas que son difíciles de analizar mediante métodos tradicionales 2-DE, como las extremadamente ácidas o extremadamente alcalinas, altamente hidrófobas, y es fácil de automatizar el análisis.
3 Tecnología de electroforesis en gel diferencial de fluorescencia (electroforesis diferencial en gel, DIGE). DIGE puede etiquetar muestras con tres tintes fluorescentes diferentes. Los tintes fluorescentes se pueden combinar de manera valente con el grupo lisina ε-amino de la proteína a través de un enlace amida. Las muestras marcadas se mezclaron y luego se separaron en el mismo gel de electroforesis bidimensional. De esta forma, se pueden obtener tres imágenes en un gel de electroforesis bidimensional, es decir, en un gel se analizan diferentes muestras de proteínas. DIGE mejora efectivamente la repetibilidad del 2-DE tradicional.
IV Métodos de proteómica cuantitativa:
⑴ Método ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos). ICAT es un tipo de método de etiquetado de isótopos estables utilizado en la investigación de proteómica cuantitativa. En el método de etiquetado de isótopos estables, la espectrometría de masas puede lograr la cuantificación identificando la diferencia en la intensidad de la señal entre los péptidos marcados y no marcados. En el método ICAT, una etiqueta isotópica con una media molécula de biotina marca los residuos de cisteína de la proteína en la muestra. Después de digerir la muestra de proteína marcada en fragmentos de péptido, se purifica mediante cromatografía de intercambio catiónico y afinidad con avidina. a la identificación por espectrometría de masas. El mismo péptido aparecerá como un doble pico en el espectro de masas y la intensidad del pico refleja directamente la intensidad relativa de la proteína correspondiente al péptido en las dos muestras. Las desventajas de ICAT son la incapacidad de marcar proteínas que carecen de residuos de cisteína, la pérdida de información de modificación postranscripcional, el rendimiento de elución inconsistente del mismo péptido en HPLC debido a diferencias en el etiquetado y el aumento de la complejidad del análisis de espectrometría de masas. [47][48].
⑵ cICAT (etiquetas de afinidad codificadas con isótopos escindibles). También es un método de marcaje de isótopos estables, basado en ICAT. cICAT utiliza 13C y biotina escindible con ácido para superar algunas de las deficiencias de ICAT.
⑶iTRAQ. El método iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) puede analizar hasta cuatro muestras diferentes simultáneamente. Este método no pierde información de modificación postranscripcional, por lo que puede usarse para estudiar modificaciones de la fosforilación de proteínas en la transducción de señales.