El principio de la PCR cuantitativa por fluorescencia es el siguiente:
La PCR cuantitativa por fluorescencia (PCR en tiempo real) se refiere a la adición de grupos fluorescentes al sistema de reacción de amplificación por PCR, a través de la reacción de amplificación A. método de detección en tiempo real de la señal de fluorescencia de cada producto del ciclo, y finalmente análisis cuantitativo de la plantilla desconocida a través de la curva estándar.
Tomemos como ejemplo el método de sonda de fluorescencia de PCR cuantitativa: durante la amplificación por PCR, se añade un par de cebadores y una sonda fluorescente específica. Los dos extremos de la sonda se marcan con un grupo fluorescente indicador y. Un fluoróforo extintor.
Al principio, la sonda está completamente unida a cualquier hebra única de ADN, y la señal fluorescente emitida por el grupo indicador es absorbida por el grupo de extinción y no se detecta ninguna señal fluorescente durante la amplificación por PCR; Enzima Taq La sonda se digiere y degrada para separar el fluoróforo indicador y el fluoróforo de extinción, de modo que el sistema de monitoreo de fluorescencia pueda recibir la señal de fluorescencia. Es decir, para cada cadena de ADN amplificada, se forma una molécula fluorescente que realiza la señal de fluorescencia. La acumulación está sincronizada con la formación del producto de PCR.
Cuando se utiliza la PCR tradicional para la detección, se requiere tinción y separación electroforética después de la reacción de amplificación, y solo puede realizar análisis cualitativos y no puede cuantificar con precisión, lo que puede causar fácilmente contaminación y falsos positivos, limitando su aplicación. . La tecnología de PCR cuantitativa en tiempo real no solo realiza la cuantificación de plantillas, sino que también tiene las características de alta sensibilidad, mejor especificidad y confiabilidad, alto grado de automatización y sin contaminación, lo que hace que la PCR cuantitativa por fluorescencia reemplace gradualmente a la PCR convencional.
En los primeros ciclos de la reacción de amplificación por PCR, la señal de fluorescencia no cambia mucho y está cerca de una línea recta. Esta línea recta se puede generar automáticamente o configurarse manualmente.
La reacción entrará entonces en una fase de crecimiento exponencial. Durante este período, la curva de amplificación es altamente repetible. Durante este período, se puede establecer una línea de umbral de fluorescencia, que se puede establecer en cualquier posición durante la fase exponencial. fase de amplificación de la señal de fluorescencia, pero generalmente la configuración predeterminada del umbral de fluorescencia es 10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia durante 3 a 15 ciclos. El número de ciclos que tarda la señal de fluorescencia en cada tubo de reacción en alcanzar el umbral establecido se denomina valor CT. Este valor está relacionado linealmente con el logaritmo de la concentración inicial y este valor es reproducible.
La mayor importancia del valor Ct es calcular el nivel de expresión del gen objetivo. En este momento, hay dos conceptos que son fáciles de mencionar, es decir, cuantificación absoluta y cuantificación relativa. La cuantificación absoluta consiste en medir el gen diana. El número de moléculas en una muestra, comúnmente conocido como número de copias. El propósito de la cuantificación relativa es determinar la proporción relativa del contenido del gen diana en dos o más muestras sin conocer su número de copias en cada muestra.
Es cierto que el valor Ct se puede utilizar para calcular estos dos resultados cuantitativos, pero el experimento cuantitativo absoluto debe utilizar un estándar absoluto con un número de copias conocido y se debe realizar una curva estándar. La cuantificación relativa se puede realizar con o sin una curva estándar. Es difícil producir estándares absolutos y obtenerlos, por lo que los laboratorios básicamente eligen métodos cuantitativos relativos para calcular la expresión genética relativa.