La ubiquitina tiene siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) y un residuo de metionina (M1). La ubiquitina está unida principalmente por residuos de lisina y residuos de metionina. La cadena de ubiquitina resultante tiene una topología determinada y la función del sustrato proteico se puede determinar mediante modificación.
La adición de ubiquitina a una proteína sustrato se denomina ubiquitinación de la proteína. La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional dinámica y multifacética involucrada en casi todos los aspectos de los eucariotas. La ubiquitina implica tres pasos principales: activación, conjugación y ligación, que se completan mediante enzimas activadoras de ubiquitina (E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2) y ubiquitina ligasas (E3). Entre ellos, hay dos tipos de E1 humano: UBA1 y UBA6. Hay 35 tipos de E2 humano y hay cientos de E3 humanos.
Las enzimas E3 tienen uno de dos dominios: el dominio HECT y el dominio RING. La ligasa E3 del dominio HECT primero se une a la ubiquitina y luego la transfiere al sustrato, mientras que la ligasa E3 del dominio RING permite que la enzima E2 transfiera la ubiquitina directamente al sustrato.
El dominio E3 de HECT se conecta al sustrato diana de ubiquitina a través de dos mecanismos: primero, la ubiquitina se transfiere desde el sitio activo de E2 a Cys en el sitio activo de E3, y luego el residuo Lys en el sustrato diana se transfiere. Ubiquitinación. Por el contrario, las ligasas RING y del dominio E3 asociado a RING sirven como andamios para la ubiquitinación de sustratos diana en un solo paso: E2 transfiere directamente la ubiquitina a los residuos de Lys en el sustrato diana.
Actualmente, la enzima E4 todavía existe en el cuerpo humano. La enzima E4 es un factor de elongación de la cadena de ubiquitina que puede extender la cadena de ubiquitina de un único sustrato de ubiquitinación para formar poliubiquitinación.
La monoubiquitinación es la adición de moléculas de ubiquitina a residuos proteicos del sustrato. La polimonoubiquitinación es la adición de una molécula de ubiquitina a múltiples residuos de sustrato. La poliubiquitinación es la formación de cadenas de proteínas ubicuas en residuos individuales de proteínas sustrato. Actualmente, los residuos de sustrato a los que puede unirse la ubiquitina son lisina, serina, cisteína y tirosina.
Según el sitio de conexión entre la ubiquitina y el sustrato, existen 9 métodos de ubiquitinación, incluidos M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63 y G76. Diferentes modos de ubiquitinación regulan diferentes funciones. Entre ellos, la ubiquitinación relacionada con la degradación proteasomal es K48.
Un estudio proteómico exhaustivo identificó miles de sitios de ubiquitinación en miles de proteínas. La mayoría de las proteínas sufren ubiquitinación en algún momento durante su vida celular.
El estudio de la degradación de ubiquitina-proteasoma en proteínas se centra principalmente en la relación entre dos proteínas, a saber, la ligasa E3 y la proteína sustrato.
La cicloheximida (CHX) es un inhibidor de la síntesis de proteínas intracelulares. MG132 es un inhibidor del proteasoma.
En la Figura 3, en comparación con el grupo no tratado de MG132, la proteína sustrato del grupo tratado con MG132 no cambió significativamente en cada momento, mientras que los niveles de proteína sustrato del grupo tratado con MG132 estaban en 2h, 4h y hubo un descenso significativo a las 8h. Muestra que la degradación del sustrato está relacionada con el proteosoma.
En la Figura 4, a medida que aumenta la expresión de la ubiquitina ligasa E3, el nivel de expresión de la proteína sustrato disminuye en consecuencia. En la Figura 5, a medida que aumenta el nivel de expresión de la mutación que inactiva la ubiquitina ligasa E3, el nivel de expresión de la proteína sustrato no cambia significativamente. En la Figura 6, el nivel de expresión de la ubiquitina ligasa E3 en las células fue reducido por el ARNip de la ubiquitina ligasa E3 y el nivel de expresión de la proteína sustrato aumentó en consecuencia. En la Figura 7, la sobreexpresión de la ubiquitina ligasa E3 reduce la vida media de la proteína sustrato. En la Figura 8, eliminar la ubiquitina ligasa E3 aumenta la vida media de la proteína sustrato. Esto sugiere que las ubiquitina ligasas E3 pueden reducir los niveles de expresión de las proteínas sustrato.
La inmunoprecipitación se utiliza para detectar la interacción entre dos proteínas.
Se dividen a grandes rasgos en los siguientes tres tipos:
Los diferentes dominios de las ubiquitina ligasas E3 y las proteínas sustrato se analizan a través de la literatura o la bioinformática. La Figura 15 muestra los diferentes dominios de la ubiquitina ligasa E3: dominio 1, dominio 2, dominio 3, dominio 4. La Figura 15 es un diagrama esquemático de los diferentes dominios de la proteína sustrato: dominioa, dominiob, dominioc y dominiod. Se utilizó inmunoprecipitación para detectar la interacción de diferentes dominios entre dos proteínas, como se muestra en la Figura 16 y la Figura 17. Después de encontrar el dominio correspondiente, se detecta la interacción entre los dos dominios, como se muestra en la Figura 18 y la Figura 19.
Normalmente, la ubiquitinación de proteínas se detecta mediante moléculas de ubiquitina expresadas exógenamente, pero también se pueden utilizar anticuerpos de ubiquitina endógena. Debido a que la ubiquitinación es el enlace de valencia entre las moléculas de ubiquitina y las proteínas sustrato, el SDS no puede interrumpir esta interacción, por lo que la presencia de cadenas de poliubiquitinación se puede observar en la Figura 20. Una molécula de ubiquitina pesa aproximadamente 8,5 KD, por lo que puede haber bandas claras en forma de escalera o bandas manchadas según la proteína sustrato en los resultados de IB.
La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional de proteínas que puede regular la función proteica. Los tipos de ubiquitinación actuales incluyen K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63, es decir, K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63 de moléculas y proteínas de ubiquitina. En general, se cree que el proteosoma puede reconocer la ubiquitinación de K48. Por tanto, es necesario confirmar que la cadena de ubiquitina de la proteína es una cadena K48. La mutación puntual única de lisina de la molécula de ubiquitina (ver Figura 21) o la mutación de retención de lisina única de la molécula de ubiquitina (ver Figura 23), y el tipo de ubiquitinación de proteína del sustrato se detectaron mediante inmunoprecipitación y transferencia Western, como se muestra en las Figuras 22 y 24.
Los cambios en los niveles de ubiquitinación de las proteínas sustrato se detectaron sobreexpresando (Figura 25) o derribando (Figura 26) la ubiquitina ligasa E3.
La ubiquitina in vitro puede eliminar el entorno complejo del cuerpo, permitiendo que la ubiquitina ligasa E3 interactúe directamente con las proteínas del sustrato, lo que hace que la ubiquitinación de las proteínas del sustrato por la ubiquitina ligasa E3 sea más convincente. Hay kits disponibles comercialmente para UB, E1, E2, ATP y tampón in vitro. Solo necesitamos purificar la ubiquitina ligasa E3 y la proteína sustrato para la reacción de ubiquitinación in vitro para detectar la ubiquitinación de la proteína sustrato.