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Autores; Jiang Wei, Fang Xiaoming, Tang Yifeng, Pang Guofang
Objetivo Establecer el análisis cuantitativo de los residuos de acetato de melengestrol, acetato de megestrol y acetato de clormadingestrol en el método de determinación de grasa. Método columna cromatográfica: Kromasil C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 micras); fase móvil: acetonitrilo-agua (65:35); velocidad de flujo: 1,0 ml/min; longitud de onda de detección: 292 nm; las muestras de resultados La tasa de recuperación es 86,7 ~ 965438 ± 0,8 y la desviación estándar relativa es 4,5 ~ 6,0. La tasa de recuperación promedio de las muestras es 865438 ± 0,4 ~ 95,0 y la desviación estándar relativa es 3,7 ~ 7,65438 ± 0. Conclusión: Este método es simple y preciso y puede usarse para la determinación de residuos de acetato de melengestrol, acetato de megestrol y acetato de clormadrol en grasa.
Cromatografía líquida de alta resolución; grasa; acetato de medroxiprogesterona; acetato de megestrol; clormadinona
Determinación de grasa en carne de vacuno y cerdo mediante cromatografía líquida de alta resolución Progesterona
Resumen Objetivo Establecer un método para la determinación de acetato de melengestrol, acetato de clormadinona y acetato de megestrol en grasa de res y cerdo. La columna del método fue c 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) y la fase móvil fue acetonitrilo-agua (65:35). El caudal fue de 65438 ± 0,0 ml/min; la temperatura de la columna fue de 35 °C; la longitud de onda de detección fue de 292 nm. Los resultados mostraron que la tasa de recuperación promedio en el laboratorio fue de 86,7 ~ 965438 ± 0,8 y la desviación estándar relativa fue de 4,5. ~ 6.0. La tasa de recuperación estándar entre laboratorios es 865438 ± 0,4 ~ 95,0 y la desviación estándar relativa es 3,7 ~ 7,65438 ± 0. El límite más bajo de cuantificación (LOQ) es 10 μg/kg. Conclusión Este método es simple y sensible. Adecuado para la determinación de acetato de melengestrol, acetato de clormadrol y acetato de megestrol en grasa de res y cerdo.
Palabras clave cromatografía líquida de alta resolución; acetato de melengestrol; acetato de clorgestrol; acetato de megestrol
Acetato de megestrol, acetato de clorgestrol El acetato de megestrol y el acetato de megestrol son fármacos progestacionales sintéticos que tienen efectos progestacionales evidentes. -Efectos androgénicos y puede inhibir la ovulación. La progesterona tiene cierto efecto inhibidor sobre la liberación de gonadotropina hipofisaria. Los experimentos con animales han demostrado que aumenta la tasa de muerte fetal y tiene efectos teratogénicos. Los efectos secundarios son: (1) náuseas, mareos y fatiga (2) sangrado intermenstrual (3) tomarlo durante el embarazo aumentará la masculinidad de las crías; . Los medicamentos de progesterona pueden mejorar la deposición de sustancias en el cuerpo, mejorar el rendimiento de la producción y producir rápidamente beneficios económicos significativos y directos, por lo que son muy atractivos para los productores. Los medicamentos de progesterona (uso no terapéutico) se han utilizado en la cría de animales durante mucho tiempo. Sin embargo, el consumo prolongado de productos cárnicos que contienen hormonas por parte de los seres humanos, incluso si el contenido es muy pequeño, afectará significativamente el equilibrio hormonal en el organismo. cuerpo y representan un riesgo de cáncer, provocando anomalías en el desarrollo de los niños y otros peligros. Por tanto, es necesario desarrollar un método capaz de detectar residuos de progesterona.
Existen muchos métodos para detectar la progesterona, como la cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) [1], la cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) [2,3] y la cromatografía líquida [ 4]-6]. Este artículo utiliza cromatografía líquida de alta resolución para detectar progesterona en grasa bovina y porcina.
1 Reactivos e instrumentos
1.1 Reactivos: acetato de melengestrol, acetato de clorgestrol, acetato de megestrol (Sigama Company), acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), acetato de etilo (HPLC grado) y otros estándares de reactivos son de grado analítico. El agua se produjo mediante el sistema de purificación Milli-Q (Millipore Corporation).
(1) Solución madre estándar: 1000 μg/ml. Pesar con precisión 0,050 g de acetato de melengestrol, acetato de clormadrol y acetato de megestrol en un matraz aforado de 50 ml y diluir a volumen con metanol. Conservado a 4°C, puede utilizarse durante un año.
(2) Mezcle la solución intermedia I: 100 μg/ml, pipetee 100 ml de soluciones madre estándar de acetato de melengestrol, acetato de clormadrol y acetato de megestrol en matraces volumétricos de 100 ml y ajuste a volumen con metanol. Conservado a 4°C, puede utilizarse durante un año.
(3) Solución intermedia mixta II: 1,0 μ g/ml, colocar 1,00 ml de solución intermedia mixta I en un matraz aforado de 100 ml y diluir a volumen con metanol. Se puede almacenar a 4 ℃ durante medio año.
(4) Solución de trabajo estándar mixta: tomar 10, 20, 40, 80 y 100 μl de solución intermedia mixta II respectivamente y agregar a 980, 970, 950, 910 y 890 μl de acetonitrilo. -agua (65:35), luego únete. Se obtuvieron soluciones de trabajo estándar mixtas con concentraciones de 0,010 µg/ml, 0,020 µg/ml, 0,040 µg/ml, 0,080 µg/ml y 0,10 µg/ml para mediciones por cromatografía líquida el mismo día.
1.2 Instrumento Sistema de cromatografía líquida Waters, cuerpo de bomba 510, detector de luz UV-visible 486, software de cromatografía Emrower pro. secador de nitrógeno (Organomation Associates, Jnc.); unidad de extracción en fase sólida (su pelco); centrifugadora criogénica (Eppendorf, Alemania); columna de extracción en fase sólida CN (3 ml, Waters). Corporación).
2 pasos de determinación
2.1 Preparación y conservación de la muestra
2.1.1 Preparación de la muestra Cortar unos 5 g de tejido adiposo de cerdo o vaca en trozos pequeños y luego colocarlos. en un embudo con lana de vidrio en el fondo, ponerlo en un vaso de precipitados de 150 ml y meter el vaso en el microondas. Dependiendo de la cantidad de grasa cocida, use la potencia máxima para calentar durante 30 a 60 segundos. Si la grasa no se derrite, calentar repetidamente durante 30 a 60 segundos después de un intervalo de 30 a 60 segundos hasta que la grasa líquida fluya y gotee en el vaso a través del embudo. Coloque el aceite graso hervido en una botella de muestra, ciérrela y etiquétela.
2.1.2 Almacenamiento de las muestras Congelar las muestras de aceite graso hervido a -18°C.
2.2 Extraer y pesar 2,00±0,01g de aceite graso hervido, colocarlo en un tubo de centrífuga de 50ml con tapón, añadir 5ml de acetonitrilo, incubar en baño María a 60°C durante 3 minutos para fundir el grasa sólida y agitar con vórtex durante 1 minuto y centrifugar a -5°C durante 7 minutos (fuerza centrífuga 1160 g). Agregue 2 x 2 ml de n-hexano al extracto de acetonitrilo combinado, agite durante 65,438 ± 0 minutos, centrifugue a -5 °C durante 5 minutos (fuerza centrífuga: 1160 g) y deseche la capa de n-hexano. El extracto de acetonitrilo se secó a 60°C con un secador de nitrógeno y el residuo se saponificó.
2.3 Saponificación: Añadir 4 ml de n-hexano, 1 ml de solución de hidróxido de sodio de 0,1 mol/L y 0,5 ml de solución de cloruro de magnesio de 1,0 mol/L al residuo (elemento 2.2) en secuencia, y mezclar uniformemente en un vórtex. Mezclar durante 10 segundos, mantener caliente en un baño de agua a 60 ℃ durante 155 minutos. Añadir 4 ml de n-hexano al precipitado, mezclar bien, calentar en un baño de agua a 60°C durante 15 minutos, centrifugar a -5°C durante 5 minutos (fuerza centrífuga 1160 g) y combinar los sobrenadantes. Secar con secador de nitrógeno a 60°C, disolver el residuo con 1,0 ml de n-hexano y purificar.
2.4 Purificación Vierta la solución de muestra saponificada (elemento 2.3) en una columna CN pretratada con 5 ml de acetato de etilo y 6 ml de n-hexano, humedezca el tubo de vidrio con 2 x 1 ml de n-hexano y vierta la solución de lavado. en la columna CN. Después de que fluya el líquido de la muestra, enjuague el cartucho con 5 ml de n-hexano y 6 ml de solución de n-hexano que contenga 5 acetato de etilo, luego encienda la bomba de vacío, descargue el líquido en el cartucho y mantenga la succión durante 2 minutos. Finalmente, se usaron 3,5 ml de acetato de etilo en n-hexano para eluir. El eluato se recogió en un tubo de ensayo de vidrio de 15 ml y se secó con un secador de nitrógeno a 60°C. El residuo se disolvió en vórtex con 990 µl de acetonitrilo-agua (65:35) y, después de reposar durante 65.438 ± 05 minutos, se añadieron, se mezclaron y se midieron 65.438 ± 00 µl de una solución de ácido clorhídrico 0,2, y se midieron mediante cromatografía líquida.
2.5 Determinación
2.5.1 Condiciones de HPLC: columna Kromasil C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 micras); precolumna: columna C18 (12,5 mm × 4,6 mm, 5 micras); ) ); Fase móvil: acetonitrilo-agua (65:35); caudal: 1,0 ml/min; temperatura de la columna: 35 °C; longitud de onda de detección: 292 nm; volumen de muestra: 40 microlitros; Cromatografía Según el contenido de las tres progesterona en la solución de muestra, se selecciona una solución de trabajo estándar con una concentración similar. Los valores de respuesta de las tres progesterona en la solución de trabajo estándar y la solución de muestra deben estar dentro del rango lineal de. la detección del instrumento. Inserte la solución de trabajo estándar y la solución de muestra en la muestra para medir. El cromatograma de la sustancia estándar en las condiciones cromatográficas anteriores se muestra en la Figura 1.
Figura 1 Cromatograma de acetato de megestrol, acetato de clorgestrol y acetato de megestrol (100ng/ml) Acetato de 1-megestrol, acetato de 2-clorgestrol, acetato de 3-megestrol
Determinación de residuos de progesterona en Grasa de cerdo y vacuno mediante cromatografía líquida de alta resolución.
3 Resultados y discusión
3.1 Rango lineal El rango de concentración de acetato de melengestrol, acetato de clorgestrol y acetato de megestrol es 0,010 ~ 0,10 μg/ml. El área del pico y la concentración mostraron una buena La relación lineal y los coeficientes de correlación (γ2) fueron mayores que 0,998.
3.2 Tasa de recuperación, precisión y límite de detección cuantitativa Este experimento utiliza dos grasas (grasa de res y grasa de cerdo) como muestras. Agregue cantidades apropiadas de estándares a la muestra de 2,0 g de modo que las cantidades añadidas sean equivalentes a 10, 20 y 50 μg/kg, y tome 24 muestras para cada nivel de adición (12 muestras para cada grasa). La Figura 2 es el cromatograma de la muestra de grasa en blanco y la muestra agregada (10 μg/kg). La Tabla 1 muestra la recuperación y precisión en interiores determinadas mediante métodos estándar externos de acetato de melengestrol, acetato de clormadrol y acetato de megestrol. La Tabla 2 muestra los resultados de recuperación y precisión entre cámaras de ocho laboratorios. Según la prueba de tasa de recuperación, la concentración más baja que se puede medir de manera confiable puede determinar el límite de detección cuantitativa (LOQ), que es 10 μg/kg, que cumple con los requisitos de detección de límites de residuos.
(1)
(2)
(3)
(4)
La figura 2 es Cromatogramas en blanco de muestra de grasa y muestra enriquecida (10 g/kg) A: Muestra en blanco de grasa de res; b: Muestra en blanco de grasa de res; c: Muestra en blanco de grasa de res; d: Muestra en blanco de grasa de cerdo; Tabla 1 Interior Resultados de recuperación y precisión (n=24 por adición)
Tabla 2 Resultados de recuperación y precisión entre laboratorios para 8 laboratorios (n=32 por adición)
Referencias
1 Huijerinck H, van Bennekom EO, nailon MWF. Detección de progestágenos en la grasa renal mediante extracción acelerada con disolventes y espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida y electropulverización. Revista de Química Anal, 2003, 483(1-2): 51-59.
2 Neidert EE, Gedir RG, Milward LJ, et al. Determinación y confirmación cualitativa de residuos de acetato de melengestrol en grasa de res mediante cromatografía de gases con captura de electrones y espectrometría de masas de ionización química por cromatografía de gases. 1990, 38(4): 979-981.
3 Impens S, Courteyn D, de Wasch K, et al. Análisis más rápido de esteroides anabólicos en la grasa renal mediante la reducción del tamaño de la muestra y el uso de cromatografía de gases-espectrometría de masas en tándem. Revista de Química Anal, 2003, 483(1-2): 269-280.
4 Gaver RC, Movahhed HS, Farmen RH, et al. Método de cromatografía líquida para análisis cuantitativo de acetato de megestrol en plasma humano. Revista de Ciencias Farmacéuticas, 1985, 74(6): 664-667.
5 Overdijk JWPM, Hermans Vai, Merkus JWPM. Determinación de concentraciones séricas de espironolactona y sus metabolitos mediante cromatografía líquida de alta resolución.
J Chromatogr B, 1985, 42(2): 279-285.
6 Campbell HM, Sauve F. Determinación de acetato de melengestrol en piensos mediante cromatografía líquida. Aeropuerto Internacional AOAC, 1993, 76(6): 1163-1167.
Determinación de residuos de progesterona en grasa de cerdo y vacuno mediante cromatografía líquida de: Thought Report Network
Materiales de referencia:
www.sixiang-huibao.com
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