Además de los elementos básicos de un vector de clonación, también cuenta con las secuencias de ADN necesarias para la transcripción/traducción, como por ejemplo un promotor.
Para eliminación de genes dirigida y edición dirigida al sitio. El shRNA que contiene la secuencia de reconocimiento del gen objetivo o ARNm puede cortar la degradación del gen objetivo o ARNm, silenciando la expresión génica y regulando negativamente la expresión de proteínas.
Ori es el sitio que controla el inicio de la replicación. Los procariotas tienen un solo origen de replicación en sus moléculas de ADN. Las moléculas de ADN eucariotas tienen múltiples sitios de origen de replicación. Es reconocido por los factores de replicación de la célula huésped y se replica utilizando el replicador del huésped para aumentar el número de copias. Debido a las diferentes máquinas de replicación del huésped, se pueden dividir en plásmidos procarióticos/eucariotas/lanzadera.
La transformación de plásmidos es un proceso muy ineficiente, con un promedio de 1 célula transformada con éxito de aproximadamente 10.000 células. Imagínese, si no existe un gen de resistencia, el tiempo para detectar clones positivos se prolongará considerablemente. Además, actividades como la replicación de plásmidos extraños consumirán los recursos de la célula huésped. En el medio de cultivo sin antibióticos, las células con plásmidos no dominan y desaparecen lentamente. En presencia de antibióticos, los genes de resistencia ayudan a las células huésped a descomponer los antibióticos y las células necesitan plásmidos.
Genes de resistencia a antibióticos: Las palabras terminarán con R mayúscula o R en superíndice.
Ampr ampicilina hidroliza el anillo β-lactámico y reduce la toxicidad de la ampicilina.
La tetraciclina puede impedir que la tetraciclina entre en las células.
Camr produce derivados de cloranfenicol hidroxiacetilo, lo que los hace tóxicos.
Neor(kanr)aminoglucósido fosfotransferasa inactiva G418 (derivado de chanamicina).
Hygr higromicina, comúnmente utilizada en Agrobacterium. Higromicina β inactivada
Kan (kanamicina, de uso común), Cmr (cloranfenicol, algunos plásmidos de expresión de levadura), SM (estreptomicina),
determinada ¿Debemos insertar el gen objetivo? ¿Lo insertamos? La mayoría de los plásmidos comerciales han sido modificados artificialmente para agregar múltiples enzimas de restricción. Promover la inserción de genes extraños.
Etiquetas comunes como 6×His, Myc, GST, etc. Los genes informadores de uso común incluyen β-galactosidasa, GFP, luciferasa, etc.
Es decir, promotor)-sitio de unión a ribosomas (RBS)-potenciador de la señal de terminación de la transcripción.
Esto se utiliza para distinguir los vectores de clonación de los vectores de expresión. Algunos elementos del sistema de expresión se agregan al vector de clonación para convertirse en un vector de expresión. ¡Es importante que los plásmidos funcionen!
Promotor: Es el sitio de unión de la ARN polimerasa y se sitúa aguas arriba del marco de expresión génica. Las secuencias promotoras controlan la unión de la ARN polimerasa y los factores de transcripción y, por lo tanto, son fundamentales para determinar cuándo y dónde se transcribe el ADN. Debido a los diferentes tipos de ARN polimerasas del huésped, los tipos de promotores en los plásmidos también son diferentes. p: Generalmente representa al promotor. Los promotores comunes incluyen: CMV, EF1 (estos dos se usan para iniciar fragmentos largos), H1, U6 (usados para iniciar fragmentos cortos, como shRNA), 35S, 2×35S (las plantas deberían saberlo).
Sitio de unión al ribosoma: generalmente AUG (codón de iniciación). Generalmente hay una secuencia SD, ubicada entre 5 y 10 pb aguas arriba del codón de inicio, complementaria al extremo 3" del ARNr 16s.
Términos Señal de terminación de la transcripción: el último exón del gen estructural tiene un AATAAA conservado. secuencia, hay una región rica en GT o T aguas abajo. Estas dos partes * * * juntas constituyen la señal de cola poli(A). El terminador común para los plásmidos de expresión bacteriana es T7, y los terminadores comunes para los plásmidos de células de mamíferos son SV40 y. SV40 Poliadenilación tardía, BGH, etc. Añade señal poli(A) para estabilizar el ARNm PA: Este es el sitio de terminación de la transcripción poli a.
Potenciador: genoma eucariota (incluido el genoma del virus eucariota). La función es independiente de la posición o dirección del potenciador.
Enlace de referencia:/p /p/824b009b901b