Resumen: Muchos péptidos bioactivos tienen composiciones específicas que hacen que estos nutracéuticos posean propiedades biológicas potenciales. La investigación sobre los péptidos fisiológicamente activos de la proteína de soja ha atraído cada vez más atención. En este estudio, se utilizó el método de fermentación Bacillus subtilis SHZ para producir harina de soja desgrasada y luego se purificaron los péptidos de soja mediante ultrafiltración y cromatografía en gel. Los efectos antifatiga y de eliminación de radicales libres de los péptidos se evaluaron in vitro e in vivo. Después de 20 días de administración de péptido de soja, se probó la resistencia a la natación de los ratones y se midieron el ácido láctico en sangre y el glucógeno hepático de los ratones. Los resultados muestran que el péptido purificado (P
Palabras clave: péptido de soja; fermentación; captador de radicales libres; antifatiga; péptido de soja desgrasado; Bacillus subtilis
El péptido de soja está compuesto por 3 - Un péptido de cadena corta compuesto por 10 residuos de aminoácidos, que es un hidrolizado de proteína de soja, se considera no sólo como un nutriente sino también en humanos debido a sus múltiples actividades biológicas, como propiedades antihipertensivas y antitrombóticas. salud.
En diferentes tipos de péptidos bioactivos (inmunoestimulantes, opioides, péptidos antimicrobianos, etc.), se ha estudiado ampliamente la actividad captadora de los péptidos de soja y de los radicales libres de oxígeno de los lípidos, del daño celular o tisular causado por el peroxidante. Las reacciones en cadena de los radicales libres se consideran actualmente una de las causas más importantes de diversas enfermedades. La fatiga es un síntoma que indica que la salud puede estar o ha sido dañada. Fisiológicamente, se sabe que los niveles de aminas biogénicas pueden causar fatiga. principales mediadores de las respuestas al estrés y las respuestas inmunes que regulan muchos eventos de señalización. Por lo tanto, la fatiga puede inducir una variedad de cambios relacionados con la regulación biológica, el sistema nervioso autónomo, el sistema endocrino y el sistema inmunológico. Estas enfermedades pueden conducir a una reducción de la intensidad del ejercicio. e incluso la interrupción de la actividad, por lo que la fatiga merece la atención de las personas modernas que suelen estar bajo estrés. Muchos informes indican que los péptidos pueden proporcionar energía inmediata durante el ejercicio y también son beneficiosos en muchos tipos de deportes. Los efectos antifatiga de los péptidos de soja Dado que la proteína de soja contiene una variedad de péptidos bioactivos precursores diferentes, se han realizado muchos estudios sobre la hidrólisis de los péptidos de soja utilizando preparaciones enzimáticas comerciales. Sin embargo, debido a su alto costo de producción, no se puede realizar. Los microorganismos ampliamente utilizados en los países en desarrollo se han considerado durante mucho tiempo una buena fuente de enzimas, y se ha demostrado que las proteínas fermentadas por microorganismos, como la leche y la soja, son ricas en hidrolizar proteínas con enzimas purificadas. en proteína (40-50), pero generalmente se considera un subproducto de bajo valor en el proceso de producción de petróleo y debería ser una buena fuente de proteína en la producción de péptidos de soja. Este estudio utiliza la fermentación de harina de soja desgrasada para producir soja. péptidos. . Después de purificar los péptidos de soja mediante ultrafiltración y cromatografía en gel, se estudiaron sus propiedades eliminadoras de radicales libres y sus efectos antifatiga mediante la fermentación de harina de soja desgrasada. La hierba cultivada se transfirió a un matraz de 250 ml que contenía 100 ml de medio de cultivo (3 g de extracto de carne, 10 g de peptona y 5 g de cloruro de sodio más 1000 ml de agua destilada, pH = 7,2). a C durante 36 horas. Compuesto por 5 (p/v) de harina de soja desgrasada, se inocularon 100 ml de líquido de semilla en un matraz de 500 ml por 100 ml de medio de fermentación y se incubaron a 30 °C durante 36 horas.
Después de la fermentación, el caldo de fermentación es 121. Desinfectar durante 20 minutos para matar los microorganismos.
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Retirar centrifugando a 5000 rpm durante 30 minutos. elimine las impurezas con un filtro de 0,45 um y recoja el hidrolizado de proteína de soja (SPH). Preparación de péptidos de soja mediante ultrafiltración y cromatografía en gel SPH
Añadir un volumen igual de SPH a la solución de ácido tricloroacético (TCA, 0,4 M). Después de media hora a temperatura ambiente, las proteínas insolubles se eliminaron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y se ajustó el pH a 7,0 con NaOH 0,4 M.
El sobrenadante resultante se fraccionó en membranas de ultrafiltración con tres rangos de corte de peso molecular diferentes (10, 31 kDa). Los fragmentos pequeños pudieron pasar a través de la membrana de 3 kDa respectivamente, mientras que el péptido de soja liofilizado no pudo pasar a través de la membrana de 1 kDa. . Para una purificación adicional, los péptidos de soja liofilizados se disolvieron en agua desionizada (10 mg/ml) y se cargaron en una columna de filtración en gel Sephadex G-25 (2,6 x 100 cm). El agua desionizada obtenida por separación se midió a 220 nm a un caudal de 0,5 ml/min y se recogió la fracción eluida (5 ml). La columna se calibró con azul dextrano 2000 MW (2000 kDa), tripsina (233 kDa), glutatión reducido (GSH) (307 Da) y glicina (75 Da). Esta sección demuestra el efecto eliminador superior de los péptidos de soja purificados y los radicales libres recolectados mediante liofilización en experimentos in vivo.
Animales y alimentación experimental
El Centro Experimental de Cría de Animales de Nanjing, China, proporcionó 96 ratones Kunming (de 3 semanas de edad, 20 ± 2 g, mitad machos y mitad machos). Los animales se mantuvieron en un ambiente con temperatura controlada de 22 grados centígrados. c. 1212h en una habitación con ciclo de luz y oscuridad. Los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices éticas del Centro Animal de la Facultad de Ciencia y Tecnología Animal de la Universidad Agrícola de Nanjing. El protocolo experimental fue aprobado por la Escuela de Ciencia y Tecnología Animal de la Universidad Agrícola de Nanjing. Los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos, cada grupo incluía 12 ratones hembra y 12 ratones macho. Después de tres días de aclimatación al medio ambiente y a una dieta estándar, los animales se mantuvieron con la siguiente dieta durante 20 días.
Durante el experimento, a todos los animales se les permitió comer libremente alimento en pellets estándar de laboratorio (compuesto por 600 g/kg de almidón, 150 g/kg de caseína, 100 g/kg de sacarosa, 50 g/kg de aceite de soja, 50 k/kg de celulosa). , 35k/kg de minerales y 10k/kg de vitaminas) y agua. Además de la dieta estándar y el consumo libre de agua, el primer grupo fue designado como grupo de dosis de control (CD) administrada por vía intragástrica con 5 ml de agua destilada por día, y el segundo grupo fue designado como grupo de dosis baja (CD) administró 100 mg/ml de péptido de soja por día), el tercer grupo fue designado como el grupo de dosis media (MD) al que se le administró 200 mg/kg al día, y al cuarto grupo se le asignó 400 mg al día. Los péptidos de soja utilizados en cada grupo se disolvieron en agua destilada de una concentración específica y luego se administraron a los ratones 5 ml de agua destilada por sonda todos los días.
Prueba de resistencia a la natación
Se seleccionaron ocho ratones de cada grupo y se les administraron diferentes dosis de péptidos de soja durante 20 días antes de realizar la prueba de natación. Hay igual número de ratones machos y hembras. La cola de cada ratón se equipó con el 5% de su peso corporal en alambre de hierro galvanizado, y luego se colocaron en agua (temperatura: 25 ± 0,5). c. Profundidad: 30 cm. Observe la resistencia a la natación de los ratones en diferentes cajas de natación (90 * 60 * 60 cm). El tiempo de resistencia se definió como el tiempo de natación que el ratón continuó nadando hasta que se hundió hasta el fondo de la caja de natación y dejó de moverse durante al menos 10 s. Se sometió a prueba T el tiempo promedio de cada grupo de ratones y los datos de diferentes grupos.
Análisis de lactato en sangre
Veinte días después de la administración de diferentes dosis de péptidos de soja, se seleccionaron 4 ratones hembra y 4 machos de cada grupo para el análisis de lactato en sangre. Finalmente, después de la administración del péptido de soja, se recogieron 20 ul de sangre de la vena de la cola de los ratones. Inmediatamente después de nadar durante 10 minutos, se recogió otra muestra de sangre de 20 ul. Después de descansar durante 20 minutos, los ratones recibieron un tercer lote de muestras de sangre.
Efecto de los péptidos de soja sobre el glucógeno hepático en ratones
III
Para determinar el glucógeno hepático de ratones se tomaron muestras de cada grupo a los 30 °C 4 ratones hembra y 4 machos. Natación forzada en agua C durante 30 minutos. Después de 90 minutos de natación, cada ratón fue anestesiado hasta la muerte con éter plástico acrílico de alta concentración y sus hígados se recogieron lo antes posible. Se utilizó el método colorimétrico de antrona para medir directamente el glucógeno hepático de ratones en diferentes grupos uno por uno.
El impacto de los péptidos de soja en el peso corporal de los ratones
Para comprender mejor el impacto de los péptidos de soja en el peso corporal, se pesó a los ratones todos los días y se midió su tasa de crecimiento. observado cuidadosamente. Después de administrar diferentes dosis de péptidos de soja durante 20 días, se analizó mediante la prueba T el aumento de peso de los ratones en diferentes grupos.
Análisis de datos
El análisis estadístico utilizó el sistema Windows SAS versión 8.02.
Se utilizó la prueba t pareada para todas las comparaciones. Los resultados representan la media y el error estándar de la media se considera significativo (P
Resultados y Discusión
Purificación de péptidos de soja y su actividad eliminadora de radicales libres
Como se describió anteriormente, se prepararon hidrolizados de proteína de soja para la purificación y se probó la eliminación de radicales libres en cada paso de purificación. Después de la filtración en gel, algunos radicales libres se separaron en tres picos según el tamaño molecular. La actividad de eliminación aumentó y la segunda parte. combinados, en el que los tres componentes tenían la mayor actividad eliminadora de radicales libres cuando la concentración de hidroxilo del péptido purificado era 65.438 00 mg/ml, es decir, aproximadamente 65.438 0,5 veces la del tocoferol, un eliminador de radicales libres bien conocido como tal. ya que los aniones superóxido y los radicales hidroxilo se reducen continuamente debido a la hipoxia en el metabolismo normal. El estrés oxidativo causado por el exceso de radicales libres provocará lesiones y daños en los tejidos. Además, la generación de estrés oxidativo puede desempeñar un papel importante en la etiología de muchos. Condiciones patológicas. Los eliminadores de radicales libres son antioxidantes preventivos cuyas actividades eliminadoras actúan como protección contra el aumento del estrés oxidativo y la recuperación del signo de fatiga. Aquí, verificamos que el péptido de soja tiene actividad eliminadora de aniones superóxido y radicales hidroxilo. experimentos vivos, las propiedades antifatiga del péptido de soja sobre el peso corporal del ratón y el efecto del tiempo de natación.
Los ratones recibieron diferentes dosis de péptidos de soja durante 20 días y se midió su peso corporal. que el aumento de peso del grupo de prueba estaba relacionado con la CD (P > 0,05), por lo que el péptido de soja no tiene un efecto significativo sobre el peso corporal. El tiempo promedio de natación de los ratones en el grupo de tratamiento fue significativamente más largo que el de los ratones de bajo peso. grupos de dosis, dosis media y dosis alta, que aumentaron en 20,965438 ± 0, 45,45 y 70, respectivamente. Estos resultados muestran que los péptidos de soja tienen un impacto significativo en la resistencia de los ratones en el experimento. La concentración de lactato en sangre de los ratones se midió antes de nadar, después de nadar y después de descansar durante 20 minutos. Se encontró que no hubo diferencias significativas en la concentración de lactato en sangre entre los grupos antes de nadar. . Sin embargo, después de nadar, la proporción de aumento en la concentración de lactato en sangre en los grupos de dosis baja, media y alta fue menor que en el grupo de cadmio (0,70) (P
El lactato en sangre es un carbohidrato utilizado para la glucólisis en condiciones anaeróbicas. La glucólisis es la principal fuente de energía para el ejercicio extenuante de corta duración. Por lo tanto, el lactato en sangre es un indicador importante de la fatiga. El porcentaje de lactato en sangre aumenta después de nadar, y la tasa de caída de lactato en sangre antes de nadar refleja la disminución del lactato en sangre después de 20 minutos de descanso, lo que representa un indicador de recuperación de la fatiga. Los datos de este estudio muestran que los péptidos de soja en la dieta se complementan después de nadar. Puede retrasar y reducir eficazmente la producción de ácido láctico en sangre, retrasar la aparición de la fatiga y acelerar la recuperación de la fatiga.
Este estudio informa por primera vez la producción de péptidos bioactivos a través de la fermentación de. Harina de soja desgrasada. Los péptidos de soja purificados mediante cromatografía en gel muestran una fuerte actividad eliminadora, pueden prolongar el tiempo de natación de los ratones, retrasar eficazmente el aumento de ácido láctico en la sangre y aumentar el almacenamiento de glucógeno hepático. considerado. ¡Una forma potencial de obtener péptidos bioactivos!