El método de secuenciación de Sanger, también conocido como reacción de terminación de cadena didesoxi, junto con el método de degradación química y sus métodos derivados, se denominan colectivamente la tecnología de secuenciación de ADN de primera generación. Es el principal método de secuenciación utilizado en la industria. Proyecto Genoma Humano y es el principal método de secuenciación del genoma humano. Se utilizó un secuenciador semiautomático basado en el método Sanger. El principio es que el núcleo de la reacción de secuenciación es el uso de ddNTP (debido a la falta de un grupo 3'-OH, no tienen la capacidad de conectarse con otro dNTP para formar un enlace fosfodiéster. Estos ddNTP pueden ser). Se utiliza para detener la extensión de la cadena de ADN. Además, estos ddNTP están vinculados con isótopos radiactivos o grupos de etiquetado fluorescente, por lo que pueden detectarse mediante instrumentos automatizados o sistemas de imágenes en gel.
Los pasos de la secuenciación son los siguientes:
En primer lugar, se amplifica el ADN a secuenciar, lo que implica copiar una gran cantidad del mismo ADN y preparar una muestra de tamaño suficiente. ↓
A continuación, se aplica calor para desnaturalizar el ADN. El ADN bicatenario se separa y se convierte en ADN monocatenario, dejando sólo la hebra sencilla inferior, llamada cadena plantilla. ↓
Combine el cebador de secuenciación con la cadena plantilla, comenzando desde la posición 3 'de la cadena plantilla (debe estar invertida en la imagen y todas las imágenes posteriores están al revés, ¡gracias a Xu Xin por corregirla! ) y agregar Los cebadores requieren un pequeño punto de partida frente a ellos porque la ADN polimerasa no puede replicarse desde cero. (¡Gracias por la corrección!) ↓
Luego, el ADN con los cebadores de secuenciación agregados se distribuyó uniformemente entre los cuatro recipientes de reacción. ¿Por qué cuatro? Porque el ADN está compuesto por 4 bases: A, T, G y C. ↓
A continuación, agregue ADN polimerasa a los cuatro recipientes de reacción. ↓
Continúe agregando condimentos y agregue las cuatro materias primas básicas (dNTP), que todavía son ácidos desoxirribonucleicos simples, en cada recipiente de reacción. ↓
A continuación, el paso clave es agregar ddNTP específicos a los recipientes de reacción. Solo se agrega un tipo de ddNTP a cada recipiente de reacción. Es un poco complicado aquí. Déjame hablar sobre qué es ddNTP específico. ddNTP es una base modificada, hay cuatro tipos, llamémoslas A*, T*, G*, C*. También se puede combinar con la base correspondiente, A*-gt, T*- gt; G*-gt; C, C*-gt; Pero a diferencia de las bases ordinarias, cuando se combinan con las bases correspondientes, pueden terminar otras combinaciones posteriores, lo que significa que la reacción en cadena del ADN ha terminado. Esto produce muchas moléculas de ADN que están completas en un lado (modelo de cadena única) e incompletas en el otro lado (debido a la presencia de ddNTP). Como se muestra en la imagen a continuación, después de agregar diferentes ddNTP↓
Tome el amarillo como ejemplo. Por ejemplo, este contenedor amarillo representa la adición de ddATP (A*). ↓
Debido a que hay ADN polimerasa, materias primas base y una base especial A*, la reacción de polimerización del ADN comienza en este recipiente. ↓
La polimerasa conecta cada base a la hebra plantilla hasta que la base especial A* (bloque amarillo con cola) y el par de bases T del bloque verde, y luego finaliza la reacción de polimerización. Aquí todo el mundo tiene que preguntarse, ¿por qué no combinarlo con los dos verdes anteriores y terminarlo directamente? Una cosa que decir aquí es que la combinación aquí se genera aleatoriamente, por lo que con un poco de suerte, se combinará directamente con el primer bloque verde y luego se terminará. Algunos se combinan con el segundo bloque verde y otros se combinan con el bloque verde posterior. De todos modos, debido a que hay suficientes muestras, según la probabilidad, cada bloque verde correspondiente tendrá la oportunidad de emparejarse con la base especial A*. La siguiente imagen es solo una de las situaciones. ↓
Reacciones similares están ocurriendo en otros contenedores. Una vez completada la reacción, coloque los productos en estos cuatro recipientes sobre el gel de electroforesis. ↓
Encendido ↓
Debido a la carga negativa impartida por su columna vertebral de fosfato, el ADN comienza a migrar desde el electrodo negativo, y el ADN más pequeño y de longitud más ligera migra más hacia el fondo. de la placa de electroforesis.
Acabamos de mencionar que debido a las diferentes posiciones donde el ddNTP se une aleatoriamente para formar moléculas de ADN incompletas, diferentes moléculas de ADN se distinguen y distribuyen en diferentes posiciones. Se utiliza marcado fluorescente para dejar marcas en la película. ↓
Reimpreso de
/p/29270914
https://zh.wikipedia.org/wiki/E6A191E6A0BCE6B58BE5BA8F