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Solución:
(1) Tampón de transferencia: pesa 2,9 g de glicina, 5,8 g Tris base, 0,37 SDS y 200 ml de metanol, agregue agua desionizada a 1000 ml, no agregue SDS si el peso molecular de la proteína es pequeño.
(2) PBS-T: NaCl 8,0 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, Na2HPO4?12H2O 2,9 g, disolver en 800 ml de agua desionizada, ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico y finalmente disolver A 1000 ml, agregue 0,05 Tween20.
(3) Solución bloqueadora: Disolver 5 gramos de leche desnatada en PBS.
(4) Solución de tinte negro amino: Disolver 0,2 negro amino en ácido acético 7.
(5) Solución decolorante de amino negro: 30% metanol, 10% solución de ácido acético glacial.
Soluciones relacionadas con SDS-PAGE
(1). Tampón de electrodo:
Tres: 6 gramos
Glicina: 28,8 gramos
p>(10) Lauril sulfato de sodio: 10 ml
Añadir 1000 ml de H2O, el valor del pH es 8,3.
(2). Tampón de gel separador: 100 ml:
Tres: 36,6 g
Ácido clorhídrico 1 N: (aproximadamente 48 ml): Valor de PH: 8,9
p>Añadir agua hasta: 100 ml.
(3). Tampón de goma concentrado: 100ml.
Tres: 5,98 g
HCL 1N: (aproximadamente 48 ml): PH:
Añadir agua hasta: 100 ml.
(4). Solución de almacenamiento en gel: 100 ml:
ACR: 30 g
Dual: 0,8 g
Añadir agua a: 100 ml .
(5).4x Tampón de Carga:
2-Me: 20 2ml
Lauril Sulfato de Sodio: 8 0,8g
Glicerina : 40 4 ml
Azul de bromofenol: 0,4 0,04 g
Tris-CL (ph6,8) 240 mM 2,5 ml (tampón gel concentrado)
Añadir 1,5 ml H2O.
Total: 10 ml
(6) Solución colorante (fórmula de tinción rápida, tinción durante 1 hora)
0,1 azul de Coomassie, 10 ácido acético, 45 metanol
Azul Coomassie R-250 1g
Metanol 450 ml
Agua 450 ml
Ácido acético glacial 100 ml
(7). Líquido decolorante: 1000ml.
Ácido acético glacial: 75 ml
Metanol: 50 ml
Agua: 875 ml
Lisado celular
(1) Tampón A: Tris 25 mM pH 7,5
KCl 50 mM
MgCl 2 mM
EDTA 1 mM
Ditiotreitol 5 mM (DTT )
(2) Lisado nuclear
NE tamponado:
Tris 25 mM pH 7,5
Cloruro de sodio 0,42 M
1,5 mm cloruro de magnesio
0,5 mm EDTA
1 mm ditiotreitol (DTT)
25 sacarosa
0,2 SDS (no se agrega inmunoprecipitación)
Agregue inhibidor de proteasa antes de la lisis celular, ¿la concentración final es de 100 mg? PMSF, 1 mg? ¿L-1 aprotinina, 2 mg? L-1 leupeptina
Paso: Electroforesis SDS-PAGE.
Prepare geles PAGE de diferentes concentraciones según el método de preparación del gel, coloque el tinte en el fondo del gel de separación mediante electroforesis y corte el suministro eléctrico. Retire el gel,
Western blotting
1. Después de la electroforesis, corte el gel usando el carril de proteína a transferir, haga una marca en la esquina inferior derecha para determinar la dirección. y lados delantero y trasero.
2 Recorta un trozo de membrana NC que sea del mismo tamaño que el gel (no más grande que el gel), márcalo en la esquina inferior derecha y sumérgelo en el tampón de transferencia durante unos 5 minutos. minutos.
3. Corte 8 trozos de papel de filtro Xinhua 1 y haga una marca en la esquina inferior derecha, que sea aproximadamente del mismo tamaño que el gel (no más grande que el gel).
4. Remoje el papel de filtro cortado en el tampón de transferencia e instale el dispositivo de transferencia en secuencia desde el ánodo al cátodo (de abajo hacia arriba): coloque el electrodo inferior plano y coloque los cuatro empapados. papeles de filtro en el electrodo inferior, alinee con precisión y coloque la membrana NC sobre el papel de filtro para eliminar las burbujas de aire. Transfiera el gel SDS-PAGE al tampón de transferencia, enjuague, colóquelo sobre la membrana NC y exprima las burbujas de aire con una varilla de vidrio. Coloque 4 trozos de papel de filtro empapado encima y suelte las burbujas de aire.
5. Coloque el electrodo superior en la capa intermedia, encienda la alimentación y enciéndala de acuerdo con el área del gel de 1 mA/cm2, y enciéndala durante 2 a 4 horas. 100 mA, 2 horas.
6. Después de la transferencia, retire el papel de filtro. Transfiera el gel a una placa de tinte Coomassie Brilliant Blue y verifique que se complete la transferencia de proteínas. Corte la membrana NC que contiene el estándar de peso molecular y colóquela en la solución de tinte negro amino durante 30 segundos, y la solución decolorante negro amino la decolorará.
7. Use agua destilada para lavar y secar la membrana NC después de la transferencia de proteínas, luego sumérjala en una solución de bloqueo a 4°C y séllela durante la noche, luego lave la membrana tres veces con tampón PBS-T. 65438 cada vez ±00min.
8. Incubar la membrana con el anticuerpo primario durante 2 horas a temperatura ambiente, diluir el anticuerpo primario con tampón PBS-T de diferentes diluciones, encontrar la concentración de anticuerpo primario más adecuada y luego usar PBS-T. tampón para Lavar la membrana 3 veces con tampón T, 10 minutos cada vez.
9. Incubar la membrana con IgG anti-ratón de cabra marcada con HRP (1:5000)* * durante 1 hora, y lavar la membrana tres veces con tampón PBS-T, 10 minutos cada vez.
10. Preparar la matriz luminiscente (mezclar la solución de matriz en 1:1).
Utiliza 11 para terminar de lavar. Tampón PBS-T, desarrolle color sobre sustrato quimioluminiscente durante 2 minutos, observe y tome fotografías con un sistema de imágenes en gel. (O desarrolle el color en solución cromogénica DAB en un lugar oscuro durante 0 a 15 minutos. Si aparece una banda que interrumpe la reacción del color, enjuague con agua inmediatamente).
Solo estoy dando un ejemplo, porque sólo los experimentos que se te ocurran son útiles. Si alguien te enseña a hacer experimentos, tus ideas seguirán a otras y es posible que otros te engañen. ¿Cuál es el punto de hacer este experimento?