La tecnología de biochips se desarrolló con el avance del "Proyecto Genoma Humano (PGH)" y es uno de los principales avances científicos y tecnológicos de mayor alcance desde mediados de los años 1990. Integra un carácter altamente interdisciplinario. Las nuevas tecnologías que integran la microelectrónica, la biología, la física, la química y la informática tienen un gran valor de investigación básica y evidentes perspectivas de industrialización. La tecnología de biochips incluye chips de genes, chips de proteínas, chips de células, chips de tejidos y nuevos biochips, como chips de microarrays de componentes, chips de microarrays de canales y chips de biosensores (1). Este artículo analiza principalmente la tecnología de chips genéticos, que proporciona una herramienta poderosa para el estudio de las funciones genéticas en el período del "proyecto posgenoma" y logrará importantes avances en el diagnóstico genético, la detección de medicamentos y la administración personalizada de medicamentos. como uno de los diez principales avances científicos y tecnológicos del mundo en 1998.
1 Concepto básico
El chip genético también se llama chip de ADN, microarray de ADN y matriz de oligonucleótidos. Se refiere al uso de medios de microimpresión o síntesis in situ originales, decenas de miles. Las sondas de ADN se solidifican en la superficie del soporte para producir una matriz de sondas de ADN bidimensional, que luego se hibrida con la muestra marcada y se detecta detectando la señal de hibridación para lograr una detección o diagnóstico médico rápido, paralelo y eficiente. muestras, debido a que los chips de silicio se usan comúnmente como soportes sólidos y la tecnología de preparación de chips de computadora se usa en el proceso de preparación, se llama tecnología de chips genéticos.
2 Proceso técnico básico
2.1 Construcción de matriz cuadrada de ADN
Seleccione oblea de silicio, oblea de vidrio, oblea de porcelana o membrana de polipropileno, membrana de nailon, etc. el soporte se procesa en consecuencia y luego se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos en superficies como obleas de silicio utilizando tecnología de fotolitografía y síntesis química fotoconductora. (2) Las sondas de cadena de oligonucleótidos se sintetizan mediante química en fase líquida o la tecnología de PCR amplifica la secuencia del gen y luego la purifica; y lo analiza cuantitativamente El replicador de matriz (dispositivo de matriz y replicación ARD), o la máquina de matriz (matriz) y el robot controlado por computadora detectan cuantitativamente con precisión y rapidez diferentes muestras de sonda en la micromatriz o chip de ADN que se obtiene colocando la membrana de nailon cargada positivamente. o oblea de silicio en la posición correspondiente para luego reticularla y fijarla con luz ultravioleta (3).
2.2 Preparación de muestra de ADN o ARNm.
Las muestras de ADN/ARNm obtenidas de sangre o tejido vivo deben amplificarse para mejorar la sensibilidad de lectura antes de etiquetarse como sondas. Mosaic Technologies ha desarrollado un sistema de PCR en fase sólida que es mejor que la tecnología de PCR tradicional. Diseñan un par de cebadores bidireccionales en el ADN objetivo y los organizan en una película de acrilamida. Este método no tiene contaminación cruzada y elimina la necesidad de líquido. procesamiento en fase Para evitar la complejidad, Lynx Therapeutics propuso otro método innovador, a saber, la clonación masiva en fase sólida. Este método puede clonar decenas de miles de fragmentos de ADN en una muestra al mismo tiempo sin separarlos y procesarlos individualmente. amplificación de muestras más eficiente y rápida (4).
Durante el proceso de amplificación por PCR, las muestras deben marcarse al mismo tiempo. Los métodos de etiquetado incluyen marcado fluorescente, marcado con biotina, marcado con isótopos, etc.
2.3 Hibridación molecular
La hibridación complementaria del ADN de la muestra y del ADN de la sonda debe seleccionar y optimizar las condiciones de hibridación según el tipo y longitud de la sonda y la aplicación del chip. Si se usa para monitorear la expresión genética, la hibridación requiere baja rigurosidad, baja temperatura, tiempo prolongado y alta concentración de sal; si se usa para la detección de mutaciones, las condiciones de hibridación son opuestas (5). Las características de la hibridación molecular en chip son que la sonda se solidifica y la muestra se marca con fluorescencia. Se puede detectar y analizar una gran cantidad de muestras biológicas a la vez, y el proceso de hibridación solo demora 30 minutos. La empresa estadounidense Nangon utiliza un método de control de campos eléctricos para reducir la velocidad de hibridación molecular a 1 minuto o incluso a unos segundos (6). Jorg Hoheisel, del Instituto Alemán del Cáncer, y otros creen que utilizar el ácido peptídico nucleico (PNA) como sonda es más eficaz.
2.4 Detección y análisis de patrones de hibridación
Utilice láser para excitar la muestra en el chip para emitir fluorescencia. Las moléculas híbridas estrictamente emparejadas tienen una mayor estabilidad termodinámica y una fuerte fluorescencia. las moléculas unidas tienen una baja estabilidad termodinámica y una señal de fluorescencia débil (menos de 1/35 ~ 1/5 de la primera) (2), mientras que las moléculas no hibridadas no tienen fluorescencia. Las señales en diferentes sitios se detectan mediante microscopía de enfoque láser o microscopía de epifluorescencia, y se procesan y analizan mediante software informático para obtener el mapa genético relevante. En la actualidad, métodos como la espectrometría de masas, la quimioluminiscencia y los métodos de fibra óptica son más sensibles y rápidos y tienden a reemplazar los métodos de fluorescencia.
3 Aplicaciones
3.1 Secuenciación
Los chips genéticos utilizan el patrón de hibridación generado por la hibridación molecular de sondas fijas y muestras para organizar la secuencia de la muestra que se va a analizar. , este método de determinación es rápido y tiene perspectivas muy atractivas. Mark chee et al. utilizaron una matriz que contenía 135.000 sondas de oligonucleótidos para determinar la secuencia completa del genoma mitocondrial humano de 16,6 kb, con una precisión del 99% (7). Hacia et al. utilizaron una micromatriz de alta densidad que contenía 48.000 oligonucleótidos para analizar las diferencias de secuencia entre los genes BRCA1 de chimpancé y humano. Los resultados encontraron que la homología de secuencia de ácido nucleico en la longitud de aproximadamente 3,4 kb del exón 11 osciló entre el 98,2% y el 83,5%. . tiempo, lo que sugiere un alto grado de similitud evolutiva entre los dos (8).
3.2 Detección de niveles de expresión génica.
La detección del nivel de expresión mediante chips genéticos puede detectar automática y rápidamente la expresión de miles de genes. Schena et al. utilizaron un microarray de ADNc de hasta 45 genes en el genoma de Arabidopsis (14 de los cuales son secuencias completas y 31 son EST) para detectar los niveles de expresión de estos genes en los tejidos de la raíz y la hoja de la planta, utilizando diferentes colores. Los productos de transcripción inversa marcados con fluoresceína se hibridaron con el microarray respectivamente. Después del escaneo con microscopía de enfoque láser, se encontró que había diferencias de expresión en 26 genes en los tejidos de la raíz y la hoja de la planta, y en el gen CAB1 involucrado en la síntesis de clorofila. se expresó de manera diferente en las hojas. La expresión tisular es 500 veces mayor que la del tejido radicular. (9) Schena et al. utilizaron una biblioteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica humana para construir una micromatriz de ADNc que representa 1046 genes para detectar las diferencias en la expresión genética de células T cultivadas in vitro en respuesta al choque térmico, y descubrieron que 5 genes eran significativamente diferentes. alterado después del tratamiento hubo una expresión alta muy obvia, con 11 genes que tenían una expresión moderadamente aumentada y 6 genes que tenían una expresión significativamente suprimida. Este resultado también se confirmó mediante marcaje de intercambio con fluoresceína de los grupos de control y tratamiento y transferencia Northern (10). Una vez finalizado el PGH, no faltan chips genómicos para detectar cambios en la expresión de todos los genes humanos en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas (11).
3.3 Diagnóstico genético
Se puede obtener un patrón estándar aislando ADN del genoma de personas normales e hibridándolo con un chip de ADN. El mapa de la lesión se puede obtener aislando el ADN del genoma del paciente e hibridándolo con un chip de ADN. Comparando y analizando estos dos mapas, se puede obtener la información del ADN de la lesión. Esta tecnología de diagnóstico por chip genético se convertirá en una nueva tecnología de diagnóstico moderna con sus características de rapidez, eficiencia, sensibilidad, economía, paralelización y automatización. Por ejemplo, Affymetrix integra la secuencia completa del gen P53 y sondas de mutaciones conocidas en un chip para formar un chip del gen P53, que desempeñará un papel en el diagnóstico temprano del cáncer. Para otro ejemplo, Heller et al. construyeron una micromatriz de ADNc de 96 genes para la detección y análisis de genes relacionados con la artritis reumatoide (AR) para explorar la aplicación de chips de ADN en el diagnóstico de enfermedades infecciosas (12). Ahora, una serie de chips de diagnóstico, como los chips de diagnóstico para la detección del virus de la hepatitis, los chips de detección de resistencia a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis y varios chips genéticos de virus relacionados con tumores malignos, están ingresando gradualmente al mercado. El diagnóstico genético es la aplicación de chips genéticos de mayor valor comercial.
3.4 Detección de medicamentos
Cómo separar e identificar los ingredientes activos de los medicamentos es un obstáculo importante al que se enfrenta la industria de la medicina tradicional china y el desarrollo de la tecnología de chips genéticos tradicionales. resolver este obstáculo. Es un método eficaz que se puede utilizar para la detección a gran escala, tiene una gran versatilidad y puede explicar el mecanismo de acción de los fármacos a nivel genético. Es decir, los chips genéticos se pueden utilizar para analizar las diferencias. Expresión genética en diferentes tejidos y órganos del cuerpo antes y después de la medicación. Si luego usa ARNm para construir una biblioteca de expresión de ADNc y luego usa la biblioteca de péptidos obtenida para hacer un chip de péptidos, puede descartar algunas de las sustancias activas de numerosos ingredientes farmacológicos.
Alternativamente, el ARN y el ADN monocatenario son muy flexibles y pueden formar estructuras espaciales complejas, que son más propicias para combinarse con moléculas objetivo. El ARN o el ADN monocatenario de la biblioteca de ácidos nucleicos se pueden fijar en el chip y luego incubar con ellos. la proteína objetivo, formando complejos proteína-ARN o proteína-ADN, que pueden detectar proteínas o ácidos nucleicos de fármacos específicos, por lo que la combinación de tecnología de chips y bibliotecas de ARN se utilizará ampliamente en la detección de fármacos. En la búsqueda de medicamentos contra el VIH, Jellis et al. utilizaron síntesis química combinatoria y tecnología de chips de ADN para detectar 654.536 nucleótidos octaméricos de fosforotioato e identificaron inhibidores con estructuras similares a XXG4XX. Los experimentos han demostrado que esta sustancia detectada tiene una eficacia significativa contra el VIH. efecto bloqueante sobre las células infectadas. (13) La tecnología de biochips aumenta en gran medida la velocidad de detección de drogas, identificación de genes diana y pruebas de nuevas drogas, y reduce en gran medida el costo. La tecnología de detección de medicamentos con chips genéticos acaba de comenzar. Muchas compañías farmacéuticas en los Estados Unidos han comenzado el trabajo preliminar, es decir, están estableciendo bases de datos de perfiles de expresión para proporcionar varios genes objetivo y métodos de análisis para la detección de medicamentos. Esta tecnología tiene un gran valor de aplicación potencial.
3.5 Administración personalizada
Clínicamente, la misma dosis de fármaco que es eficaz para el paciente A puede no serlo para el paciente B, y puede tener efectos secundarios para el paciente C. Las respuestas de los pacientes varían ampliamente en términos de eficacia del fármaco y efectos secundarios. Esto se debe principalmente a diferencias en la genética de los pacientes, como los genes de respuesta a los medicamentos, que conducen a diferentes respuestas a los medicamentos. Por ejemplo, la enzima citocromo P450 está relacionada con el metabolismo de aproximadamente el 25% de los fármacos más utilizados. Si el gen de esta enzima de un paciente sufre una mutación, tendrá efectos secundarios importantes sobre el fármaco antihipertensivo isoquina. Los caucásicos tienen deficiencia en la actividad del gen enzimático de esta enzima. Ahora está claro que existen variaciones generalizadas en estos genes que, además de producir diferentes respuestas a los fármacos, también están asociadas con la susceptibilidad a diversas enfermedades como tumores, enfermedades autoinmunes y la enfermedad de Parkinson. Si la tecnología de chips genéticos se utiliza para diagnosticar a los pacientes primero y luego recetar, se puede implementar un tratamiento individual optimizado para los pacientes. Por otro lado, en el tratamiento, las causas específicas de muchas de las mismas enfermedades varían de persona a persona, y los medicamentos también deberían variar de persona a persona. Por ejemplo, existen muchos subtipos de hepatitis B y múltiples sitios en el gen del VHB, como las regiones de los genes S, P y C, son propensos a mutaciones. Si se utiliza el chip de detección del polimorfismo del gen del virus de la hepatitis B para detectar el virus de la hepatitis B a intervalos regulares, es muy significativo guiar la medicación para prevenir la resistencia a los medicamentos del virus de la hepatitis B. Por poner otro ejemplo, los medicamentos que se utilizan actualmente para tratar el SIDA son principalmente inhibidores de la transcriptasa inversa RT y la proteasa PRO virales. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos a menudo ocurre después de 3 a 12 meses de medicación. La razón es que se generan una o más manchas en la rt. y progenes. Los cuatro sitios de mutación comunes del gen Rt son Asp67 → Asn, Lys70 → Arg, Thr215 → Phe, Tyr y Lys219 → Glu. Las mutaciones en los cuatro sitios aumentan la tolerancia al fármaco cientos de veces en comparación con una mutación de un solo sitio (14). Si la secuencia completa de estos sitios de mutación genética se construye como un chip de ADN, se puede detectar rápidamente si el paciente tiene mutaciones en uno o ese gen o en varios genes, y se puede prescribir el medicamento adecuado, por lo que es de gran importancia para guiar el tratamiento. y pronóstico.
Además, los chips genéticos tienen un gran valor de aplicación en el descubrimiento de nuevos genes, el mapeo farmacogenómico, la identificación de especies de la medicina tradicional china y la investigación informática del ADN.
4 Situación actual y perspectivas de los chips genéticos en el país y en el extranjero
Desde 1996, la empresa estadounidense Affymetrix produjo con éxito los primeros biochips del mundo para la detección de drogas y pruebas de laboratorio, y un sistema de chip. se produjo (15) Desde entonces, países de todo el mundo han logrado rápidos avances en la investigación de chips y han seguido logrando nuevos avances. Hyseq, Syntexi, Nanogen, Incyte en los Estados Unidos y varios países de Japón y Europa están llevando a cabo activamente investigaciones sobre chips de ADN; empresas multinacionales como Motorola, HP e IBM también han invertido mucho en la investigación de chips. En diciembre de 1998, Affymefrix y Molecular Dynamics anunciaron el establecimiento del Consorcio de Tecnología de Análisis Genético para desarrollar una plataforma tecnológica unificada para producir equipos más eficaces y asequibles. En respuesta, la británica Amershcem Pharmacia Biotechnology también anunció el mismo día que lo haría parcialmente. La tecnología dominada se pondría a disposición para promover su aplicación (16).
Los Estados Unidos celebraron dos conferencias sobre tecnología de chips, en las que el presidente Clinton elogió y afirmó mucho la tecnología y consideró los chips genéticos como una brújula para garantizar la salud durante toda la vida (17). Se espera que las ventas de biochips alcancen entre 20 y 30 mil millones de dólares estadounidenses en los próximos cinco años, según la predicción de la revista Fortune (97,3), en el siglo XXI, el impacto de los biochips en los seres humanos probablemente superará al de los chips microelectrónicos; .