Analiza el estado de desarrollo y la historia de los microscopios electrónicos, presenta la estructura, los principios y las aplicaciones de varios microscopios electrónicos avanzados en el campo de la biología y analiza su aplicación en histología. Aplicaciones en investigación. Palabras clave: Microscopía electrónica; Introducción a la investigación histológica: La microscopía es una tecnología de análisis microscópico utilizada específicamente para el análisis de la composición química, la observación morfológica microscópica y la determinación de la microestructura de pequeñas áreas de materia. En la década de 1930, la invención del microscopio electrónico de transmisión marcó el nacimiento de la microscopía electrónica, que permitió seguir estudiando la ultraestructura de la materia. Sobre la base de la tecnología de microscopía óptica ordinaria, la tecnología de microscopía electrónica ha ampliado aún más los horizontes de observación de las personas, ha desempeñado un papel importante en diversos campos y se ha utilizado ampliamente en el campo científico. En el campo de la investigación biológica, la tecnología de la microscopía electrónica ha promovido el desarrollo de la histología, la biología celular, la biología molecular y otras disciplinas y, por lo tanto, tiene un estatus elevado e insustituible.
1. Tecnología del Microscopio Electrónico
1.1 La definición y composición de un microscopio electrónico, denominado microscopio electrónico, se basa en los principios de la óptica electrónica, utilizando haces de electrones y lentes para reemplazar los haces de luz y las lentes ópticas, de modo que Un instrumento que obtiene imágenes de la estructura fina de la materia con un aumento extremadamente alto [1] Un microscopio electrónico consta de tres partes: un cilindro de lente, un dispositivo de vacío y un gabinete de energía. El tubo de la lente se compone principalmente de una fuente de electrones, una lente de electrones, un soporte de muestra, una pantalla fluorescente y un detector, y generalmente se ensambla en una fila de arriba a abajo. ①Lente electrónica: se utiliza para enfocar electrones y es el componente más importante del cilindro del microscopio electrónico. Generalmente se utilizan lentes magnéticas y, en ocasiones, lentes electrostáticas. Utiliza un campo eléctrico espacial o campo magnético que es simétrico al eje del cilindro de la lente para doblar la trayectoria del electrón hacia el eje para formar un foco. Su función es la misma que la de la lente óptica (lente convexa) en una óptica. microscopio para enfocar el haz de luz, por eso se llama lente electrónica. La distancia focal de la lente óptica es fija, mientras que la distancia focal de la lente electrónica es ajustable, por lo que el microscopio electrónico no tiene un sistema de lentes móviles como el microscopio óptico. La mayoría de los microscopios electrónicos modernos utilizan lentes electromagnéticas, en las que se hace pasar una corriente de excitación CC muy estable a través de una bobina con zapatas polares para producir un fuerte campo magnético para enfocar los electrones. ②Fuente de electrones: Consta de un cátodo que libera electrones libres, una rejilla que acelera los electrones y un ánodo en forma de anillo. La diferencia de voltaje entre el cátodo y el ánodo debe ser muy alta, normalmente entre unos pocos miles de voltios y tres millones de voltios. Puede emitir y formar haces de electrones con velocidad uniforme, por lo que se requiere que la estabilidad del voltaje de aceleración sea al menos una diezmilésima. ③Grid de muestras: la muestra se puede colocar de manera estable en el gradilla de muestras. Además, a menudo existen dispositivos que se pueden utilizar para cambiar la muestra (como mover, rotar, calentar, enfriar, estirar, etc.) (4) Detector: se utiliza para recopilar señales electrónicas o señales secundarias.
1.2 Principios básicos Los diferentes tipos de microscopios electrónicos tienen diferentes principios de obtención de imágenes, pero todos utilizan campos electromagnéticos para desviar y enfocar haces de electrones y luego estudian la estructura de la materia basándose en el principio de interacción entre electrones y materia. . Entre ellos, el haz de electrones generado por el microscopio electrónico de transmisión hace converger mediante el condensador y se irradia uniformemente al área que se observará en la muestra, y los electrones incidentes interactúan con el material de la muestra. Debido a que la muestra es muy delgada, la mayoría de los electrones penetran en la muestra y su distribución de intensidad corresponde a la morfología, organización y estructura del área de la muestra observada. Los electrones proyectados desde la muestra son amplificados por la lente magnética de tres niveles y proyectados sobre la pantalla fluorescente para observar el patrón. La pantalla fluorescente convierte la distribución de intensidad de los electrones en una distribución de intensidad de luz visible para el ojo humano, mostrándose así en el fluorescente. Pantalla la forma, organización y estructura correspondiente a la imagen. Un microscopio electrónico de barrido (SEM) utiliza un haz de electrones enfocado impulsado por una bobina para escanear y obtener imágenes de la superficie de la muestra punto por punto. Las señales de imagen son electrones secundarios, electrones retrodispersados o electrones absorbidos. El detector recoge la señal eléctrica secundaria y la convierte en una señal eléctrica. Después del procesamiento, se obtiene una imagen electrónica secundaria que refleja la topografía de la superficie de la muestra. Las imágenes de electrones retrodispersados reflejan la distribución elemental de la muestra y el contorno de regiones con diferentes composiciones de fases. Además, debido a la longitud de onda de De Broglie más corta de los electrones, la resolución es mucho mayor que la de los microscopios ópticos, alcanzando 0,1 ~ 0,2 nm, y el aumento oscila entre decenas de miles y millones de veces.
1.3 Historia del desarrollo tecnológico El primer microscopio electrónico de transmisión (TEM) del mundo fue desarrollado con éxito en 1931 por los científicos alemanes Ruska y Knoll.
Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska continuó investigando y mejorando TEM, creando un microscopio con un aumento de más de 6,5438 millones de veces, por el que ganó el Premio Nobel de Física. El ingeniero británico Charles inventó el primer microscopio electrónico de barrido (SEM) del mundo en 1952 basado en TEM. Los microscopios electrónicos de barrido se utilizan principalmente para observar muestras gruesas con grandes diferencias de altura y rugosidad. Por lo tanto, el diseño resalta el efecto de profundidad de campo. Generalmente se utiliza para analizar fracturas y superficies naturales sin procesamiento manual. Sin embargo, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) destaca la alta resolución. La observación de muestras con TEM puede obtener imágenes ultraestructurales de alta resolución, que se utilizan ampliamente en ciencia de materiales y biología, y también es una herramienta de diagnóstico para patología. La clave de esta tecnología es la preparación de secciones ultrafinas. Después de eso, nacieron uno tras otro, la microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FE-SEM), la microscopía iónica de campo (FIM), la difracción de electrones de baja energía (LEED), el espectrómetro de energía Auger (AES) y el espectrómetro fotoelectrónico (ESCA). han sido ampliamente utilizados en diversos campos científicos y desempeñaron un papel importante en la investigación. En 1981, G. Binnig y H. Rohrer desarrollaron con éxito el primer microscopio de efecto túnel (STM) del mundo y ganaron el Premio Nobel de Física. Su aparición permitió a los humanos observar en tiempo real la disposición de los átomos individuales en la superficie de la materia y las propiedades físicas y químicas relacionadas con el comportamiento de los electrones de la superficie. Fue reconocido por la comunidad científica internacional como uno de los más importantes del mundo. Los diez principales logros científicos y tecnológicos del decenio de 1980. El microscopio de efecto túnel (STM) es un nuevo tipo de instrumento que utiliza la corriente de efecto túnel entre la punta del conductor y la muestra, y utiliza un cristal piezoeléctrico de precisión para controlar la punta del conductor para escanear a lo largo de la superficie de la muestra, registrando así la topografía de la superficie del muestra a escala atómica. Su resolución alcanza 1 nm ~ 2 nm y se puede utilizar para estudiar la morfología de la superficie de varios metales, semiconductores y muestras biológicas, así como la deposición superficial, la difusión atómica superficial, la nucleación y el crecimiento de partículas superficiales, la adsorción y la desorción. Tras la aparición de STM, se han desarrollado una serie de nuevas técnicas de microscopía con principios de funcionamiento similares, incluida la microscopía de fuerza atómica (AFM), la microscopía de fuerza lateral (LFM), etc. Estos microscopios basados en sondas que escanean y obtienen imágenes de muestras se denominan colectivamente microscopios de sonda de barrido (SPM). La microscopía de sonda de barrido es el método más importante y fundamental en nanometrología, nanocaracterización y medición. Puede utilizar la sonda atómica y la superficie de la muestra a medir como componentes principales para completar el escaneo entre la sonda y la muestra en las direcciones X e Y, mientras simula la fluctuación de la superficie de la muestra en la dirección Z. La morfología de la superficie de la muestra se observa cambiando la cantidad física generada por la interacción entre la sonda y la muestra a medida que la superficie de la muestra ondula. El instrumento tiene alta resolución, con resolución horizontal de hasta 0,1 nm y resolución vertical de hasta 0,01 nm. Puede observar y determinar directamente la imagen tridimensional de la muestra, y puede observar en la atmósfera, en el vacío o incluso en líquidos a alta o baja temperatura. Se puede detectar sin tocar la muestra, por lo que no dañará la muestra y no requiere irradiación con haz de electrones, por lo que no causará daños por radiación a la muestra.
Dos. El desarrollo de la tecnología del microscopio electrónico en China En 1958, China desarrolló con éxito el primer microscopio electrónico. En 1988, Bai Chunli y Yao Junen, de la Academia de Ciencias de China, desarrollaron el primer STM de China. [2] En 2000, la Sociedad China de Microscopía Electrónica contó menos de 2.000 equipos en China continental. Después de que China se unió a la OMC, su desarrollo económico, su investigación científica, su educación y su estructura industrial mejoraron. Actualmente, el mercado de microscopios electrónicos de China está creciendo casi 100 unidades por año. Se puede esperar que la capacidad de mercado de microscopios electrónicos de China ocupe el primer lugar en el mundo en los próximos años. En microscopios electrónicos en el mercado chino, JEOL ocupa el primer lugar con una cuota de mercado de más del 50%. Seguido por Fei (anteriormente Departamento de Microscopía Electrónica de Philips), Hitachi (agente) de Japón, Alemania (anteriormente Leo de Alemania) y Shimadzu de Japón. En términos de fabricantes nacionales, son principalmente Zhongke Yike, Nanjing Jiangnan Optoelectronics y el Instituto de Tecnología Óptica Electrónica de Shanghai. Sus productos se concentran principalmente en el mercado de microscopios electrónicos de barrido de gama baja. Si se analiza la situación general del mercado, la cuota de mercado nacional de los microscopios electrónicos de producción nacional es inferior al 10%. Se puede ver que todavía hay mucho margen de mejora en los microscopios electrónicos nacionales de mi país. En términos de tipo, los microscopios electrónicos de barrido representan el 63,61 del número total de microscopios electrónicos en mi país y los microscopios electrónicos de transmisión representan el 36,39. Se puede ver que los microscopios electrónicos de barrido tienen una base de usuarios más amplia en mi país.
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3. Tendencias de desarrollo futuro de la tecnología de microscopía electrónica
3.1 Tecnología de microscopía electrónica remota Desde la década de 1990, con el desarrollo de la tecnología informática y la tecnología de redes, la tecnología de microscopía electrónica remota ha evolucionado. Los microscopios electrónicos remotos surgieron gradualmente y pueden mostrar información en tiempo real obtenida en el laboratorio a usuarios remotos, permitiéndoles ver imágenes de muestras en tiempo real a través de Internet y operar el instrumento de forma remota para completar experimentos. [4] La clave de la tecnología de microscopía electrónica remota radica en la adquisición, compresión y transmisión de imágenes. En términos de adquisición de imágenes, los microscopios electrónicos actuales han logrado grandes avances. Los microscopios electrónicos antiguos utilizan principalmente cámaras digitales y tarjetas de captura de video para recopilar imágenes, mientras que los microscopios electrónicos nuevos utilizan principalmente tarjetas de captura VGA para recopilar imágenes, lo que se ha convertido en una tendencia de desarrollo futuro. Además, están surgiendo nuevos métodos de recopilación de imágenes mediante software. Al principio, la compresión de imágenes JPEG se utilizaba para la compresión de imágenes, donde el usuario remoto veía una serie de imágenes de muestra estáticas independientes. Ahora, con el desarrollo de la tecnología, los algoritmos de compresión de vídeo como MPEG4-4 y H.264 se aplican gradualmente a la compresión de imágenes de muestra. En la actualidad, las imágenes de muestra se transmiten principalmente a través de los protocolos TCP y UDP, pero estos dos protocolos ocupan demasiado ancho de banda y el efecto de transmisión no es ideal. Para mejorar el rendimiento de la transmisión, se están estudiando un modelo de transmisión de red "piramidal" de sistema de transmisión de datos dedicado y una red de transmisión patentada, que también es la dirección de mejora de la microscopía electrónica remota en esta etapa. En 1990, Carl Zmola y otros se dieron cuenta de la transmisión en red de imágenes de muestras de microscopios electrónicos de barrido y establecieron por primera vez un sistema de transmisión en tiempo real para imágenes de muestras de microscopios electrónicos remotos. Posteriormente, las universidades americanas crearon sus propios sistemas remotos SEM. La eficiencia de la transferencia de muestras también ha mejorado considerablemente. Inicialmente, en una red de fibra óptica de 800 Mb, la eficiencia de transmisión de imágenes de muestra era de 1 cuadro cada 17 segundos. En el año 2000, en una red de 1 a 2 Mb, la transmisión de imágenes de muestra podría alcanzar 5 fotogramas por segundo. Todavía hay mucho margen de mejora técnica. En nuestro país, aunque existen miles de microscopios electrónicos en universidades e instituciones de investigación científica, todavía no pueden satisfacer las crecientes necesidades de aplicación. Por lo tanto, la investigación sobre tecnología de microscopía electrónica remota tiene un importante valor de aplicación para nuestro país.
3.2 Tecnología de microscopía crioelectrónica La tecnología de microscopía crioelectrónica es una tecnología que utiliza métodos de congelación (físicos) para preparar muestras biológicas y observarlas, por lo que se utiliza ampliamente en histología biológica. En comparación con las técnicas convencionales de microscopía electrónica (métodos químicos), puede mantener el estado fisiológico de la muestra en mayor medida y puede usarse para estudiar el proceso dinámico de macromoléculas biológicas y analizar la estructura tridimensional del tejido nuclear.
3.3 Tecnología de reconstrucción tridimensional bajo microscopio crioelectrónico La tecnología de imágenes tridimensionales del microscopio electrónico es el producto de la combinación perfecta de microscopio electrónico y computadora. Utiliza un microscopio electrónico para recopilar imágenes de proyección bidimensionales de la muestra y reconstruye la estructura espacial tridimensional de la muestra mediante procesamiento por computadora. La tecnología de imágenes tridimensionales se utiliza ampliamente en el campo de la biología, especialmente en el análisis de la estructura tridimensional de proteínas. Las primeras tecnologías de imágenes tridimensionales utilizaban principalmente soluciones de sales de metales pesados para teñir las muestras.