La metilación del ADN es uno de los primeros métodos de modificación epigenética genética descubiertos. La metilación en eucariotas sólo se produce en la citosina, es decir, mediante la acción de las metiltransferasas del ADN (DNMT). el dinucleótido CpG se convierte en 5'-metilcitosina. La metilación del ADN suele inhibir la expresión génica, mientras que la desmetilación induce la reactivación y expresión de los genes. Este método de modificación del ADN logra la regulación de la expresión genética sin cambiar la secuencia del gen. El estado de metilación del ADN de los vertebrados está estrechamente relacionado con la regulación del crecimiento y el desarrollo. Por ejemplo, durante la aparición de un tumor, aumenta el grado de desmetilación de las secuencias CpG distintas de la isla CpG del gen supresor de tumores, mientras que el CpG en la isla CpG. se vuelve altamente metilado, lo que resulta en una disminución en la expresión de genes supresores de tumores.
1. PCR específica de metilación (MSP)
El ADN genómico se trata con bisulfito y todas las citosinas no metiladas se convierten en uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios; Luego se diseñan secuencias para PCR. El producto de amplificación de MSP se detecta mediante electroforesis. Si el fragmento amplificado se puede obtener utilizando un cebador dirigido a la cadena de ADN metilado después del tratamiento, significa que hay metilación en el sitio detectado; de lo contrario, significa que no hay metilación en el sitio detectado. .
2. Secuenciación por PCR con bisulfito (BSP)
Utilizando bisulfito para tratar el ADN genómico, la citosina no metilada se convierte en uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios. Luego, los cebadores BSP se diseñan para la PCR. Durante el proceso de amplificación, todo el uracilo se convierte en timina. Finalmente, la secuenciación del producto de la PCR puede determinar si se ha producido la metilación del sitio CpG, lo que se denomina método de secuenciación directa BSP. Clonar el producto de PCR en un vector y luego secuenciarlo puede mejorar la tasa de éxito de la secuenciación. Este método se denomina método de secuenciación de clonación BSP.
3. Fusión de alta resolución (HRM)
Diseñar un par de cebadores en posiciones de islas no CpG para dobles hebras de ADN modificado con bisulfito, el fragmento en el medio de este par de cebadores. contiene la isla CpG de interés. Si estas islas CpG están metiladas, después del tratamiento con bisulfito, la citosina no metilada se convertirá en timina después de la amplificación por PCR, mientras que la citosina metilada permanecerá sin cambios y el contenido de GC en la muestra cambiará, lo que resultará en cambios en la temperatura de fusión (Figura 1).
Entre ellos, requisitos de muestra: células (≥106), tejido (≥300 mg), sangre (≥1 ml), suero (≥1,5 ml) y otros materiales de muestra, ADN genómico (volumen ≥20 μl, concentración ≥ 50 ng/μl).