Marguerita de Valois fue la séptima hija de Enrique II y Catalina de Médicis, y la hija menor superviviente. Lleva el nombre de su madrina, Margarita de Valois-Angouleme, que también era tía. Entre sus hermanos se encuentran cuatro reyes o reinas europeos y una duquesa. Son sus dos hermanas Isabel (la tercera esposa de Felipe II) y Clodia (la hija de Carlos III, esposa del duque de Lorena) y sus hermanos Francisco II, Carlos). IX y Enrique III.
Marguerite no tuvo una profunda impresión de su padre porque éste murió en una justa en la boda de su hermana Isabel y Felipe II. En aquel momento, Margarita sólo tenía seis años. Los sentimientos de Margaret hacia su madre eran profundamente ambivalentes, llenos de admiración y miedo. Tenía un profundo afecto por sus hermanas y su hermano menor, François Hercule, pero se resistió mucho a su hermano mayor Henry desde una edad temprana, e incluso en sus últimos años los dos fueron muy hostiles entre sí durante un período de tiempo. . Hay poca evidencia de su relación con su hermano mayor, excepto que fue él quien le dio a Margaret el apodo de Margot y continuó usándolo.
La relación entre ella y su marido es de lo más llamativa, ya que se intercala con las historias de las amantes de Enrique de Navarra. Aunque tenía poca influencia política, Margaret en un momento fue leal a la postura política de Henry y lo defendió ferozmente a él y sus propósitos políticos, y al momento siguiente de repente estaba completamente en contra de él y tratando de sabotear sus planes. En los años posteriores a la anulación de su matrimonio, se desarrolló una larga disputa entre ellos.