Interferencia de ARN.
Interferencia por ARN.
Los experimentos de ARNi utilizando parásitos adultos se basaron en métodos optimizados para Schistosoma [39], aunque los procedimientos se han descrito previamente [37, 38].
El experimento de ARNi (interferencia del ácido ribonucleico) del parásito adulto se basa en un método optimizado para larvas de Schistosoma japonicum [39], aunque el procedimiento ha sido descrito previamente [37, 38].
En resumen, los parásitos cultivados in vitro se empaparon con 20-30 mg de ARNbc recién agregado los días 65-438+0-3 y cada 5-6 días a partir de entonces.
En resumen, los parásitos cultivados in vitro se empaparon con 20-30 mg recién añadidos de ARN bicatenario en los días 1-3, y luego se agregaron cada 5-6 días.
Como control negativo, los animales se empaparon con dsRNA sintetizado a partir de ccdB y camR que contenía el inserto pJC53.2 (ref. 29).
Con ccdB y camR que contenían el pjc53.2 Aditivo Los animales se empaparon con ARN bicatenario sintético como control negativo (Ref. 29).
La síntesis de ARNbc se realizó como se describió anteriormente [29]. Las secuencias utilizadas para generar dsRNA se proporcionan en la Figura 9 complementaria.
La síntesis de ARN bicatenario se realizó como se describió anteriormente [29]. La secuencia que generó el ARN bicatenario se muestra en la Figura complementaria 9.
Para medir los niveles de ARNm, se transcribió de forma inversa el ARN total de los parásitos control y knockout (8 fragmentos somáticos posteriores masculinos) (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad) y se incubó en una PCR cuantitativa aplicada en tiempo real. utilizando GoTaq qPCR Master Mix con SYBR green (Promega) en el instrumento Bio-systems Step One Plus.
Para determinar los niveles de ARNm (ARN mensajero), el ARN total (8 fragmentos de metasoma positivos) del control y los parásitos desintegrados se transcribió de forma inversa (kit de síntesis BioRad) usando GoTaq que contiene el kit verde SYBR de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR). Supermix Kit, realiza reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real en instrumentos del Departamento de Biología Aplicada.
Los niveles de transcripción se normalizaron a los niveles de ARNm de la subunidad beta tipo 4 del proteosoma (smp_056500).
Los niveles de transcripción se normalizaron a los niveles de ARNm de la subunidad beta del proteosoma tipo 4 (smp_056500).
Utilice el cálculo DDCt en el software Step One Plus para calcular cantidades relativas. Las secuencias de cebadores de oligonucleótidos se enumeran en la Tabla complementaria 3.
Los importes relativos se calcularon utilizando el método de cálculo DDCt en el software Step One Plus. Las secuencias básicas de los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla complementaria 3.