1.3.1.1 Marcadores de proteínas (análisis de isoenzimas)
Un método común para evaluar la variación genética es la electroforesis de isoenzimas. El análisis de isoenzimas se utiliza para distinguir especies de Trichoderma estrechamente relacionadas (Szekeres et al., 2006) y permite un análisis rápido y económico de un gran número de cepas de Trichoderma. Diferentes secuencias de aminoácidos conducen a diferentes propiedades proteicas y también cambian la tasa de migración en la electroforesis en gel de poliacrilamida (Rosendahl et al., 1992). Después de la electroforesis, la diversidad de diferentes enzimas puede reflejarse intuitivamente comparando los espectros de tinción publicados (Pasteur et al., 1988; Harris et al., 1976).
Zamir et al (1985) utilizaron por primera vez Isozyme. El análisis caracterizó las especies de Trichoderma y clasificó 23 cepas de Trichoderma harzianum de diferentes ubicaciones geográficas en cinco tipos. Los resultados indican que la electroforesis de isoenzimas es muy útil para diferenciar especies de Trichoderma a nivel interespecífico. Stasz et al. (1988a) utilizaron electroforesis horizontal en gel de almidón para evaluar 63 enzimas de Trichoderma para el análisis cladístico de la filogenia de Trichoderma. Samuels et al. (1994) utilizaron análisis en gel de almidón de 23 enzimas para detectar Trichoderma longibranquios, Trichoderma pseudoconi y Trichoderma reesei. Szekeres et al. (2006) encontraron que 7 enzimas adecuadas pueden identificar Trichoderma pseudoconi, Trichoderma coni o Trichoderma citric. Los resultados de la clasificación respaldan el sistema de clasificación de Trichoderma basado en las características morfológicas de Bissetts (1992). Grondona et al. (1997) analizaron las características morfológicas, fisiológicas, moleculares y bioquímicas de 15 cepas de Trichoderma harzianum, así como 99 bandas de isoenzimas de 6 sistemas de isoenzimas, y dividieron las 15 cepas en 4 grupos mediante clasificación numérica. Siddiquee et al. (2007) estudiaron las diferencias electroforéticas en nueve isoenzimas codificadas por 14 loci para diferenciar 47 cepas de las especies de Trichoderma Trichoderma harzianum, Trichoderma chrysanthemi y Trichoderma longifolia. Juck Zhang et al. (2012) examinaron 21 cepas de 14 especies de Trichoderma, utilizaron la secuencia conservada de fitasa para diseñar y fusionar los cebadores P8205 y P500-2, obtuvieron el fragmento del gen de la fitasa y establecieron un árbol filogenético. Los resultados mostraron que la secuencia del gen fitasa era diversa, lo que era básicamente consistente con los resultados de la clasificación basados en secuencias ITS.
La electroforesis en gel de proteínas solubles también es un método importante para la identificación y clasificación de hongos. Por ejemplo, Chen Jianai et al. (1999) utilizaron electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas solubles para analizar los patrones característicos de 26 cepas de Trichoderma de 6 especies y descubrieron que había diferencias significativas en los patrones de electroforesis de proteínas entre especies y que las cepas dentro de las especies eran básicamente las mismas. mismo. Xiao Xinglong et al. (2002) realizaron un análisis de electroforesis de proteínas solubles en 61 cepas diferentes de Trichoderma y los resultados mostraron que existen taxones de subespecies de Trichoderma harzianum.
1.3.1.2 Tecnología de análisis de microplacas BIOLOG
El método de análisis de microplacas BIOLOG es un método para analizar características fisiológicas a nivel comunitario. Un método consiste en utilizar el sistema Biolog GN para estudiar la utilización de la fuente de carbono de los microorganismos en función de sus diferentes capacidades de utilización de la fuente de carbono. Cada pocillo de la placa de microtitulación Biolog GN contiene una fuente de carbono diferente, otros nutrientes y colorante de tetrazolio. La suspensión microbiana se inocula en los pocillos de la placa de microtitulación. Dado que diferentes microorganismos utilizan diferentes fuentes únicas de C en diferentes grados e intensidades, producirán diferentes reacciones metabólicas bioquímicas, mostrando así diferentes colores. Este cambio de color se puede medir y registrar con un lector de microplacas para obtener la "huella metabólica" única del microorganismo.
Según la huella metabólica de los microorganismos del suelo, combinada con el software informático relevante y los datos de la biblioteca de cepas existentes, se pueden clasificar e identificar algunos microorganismos (Winding et al., 65438
Introducido por Kubicek et al. (2003) Se utilizó la microplaca Biolog FF para estudiar las diferencias en las características fenotípicas y fisiológicas de las especies de Trichoderma. La utilización de 95 fuentes de carbono y la actividad mitocondrial de las cepas de Trichoderma se midieron mediante colorimetría de luz (96 h, midiendo la turbidez para indicar el crecimiento de las hifas). (2003) también utilizó el método Biolog para determinar 7 nuevas especies en Asia utilizando secuencias ITS y EF-1a. Se puede ver claramente en el árbol filogenético que el árbol filogenético B4 se puede dividir en los siguientes árboles subevolutivos: Trichoderma. harzianum, Trichoderma helix y Trichoderma virens (2006a). La tecnología de microarrays de Biolog evaluó la utilización de 95 fuentes de carbono por Trichoderma reesei y comparó las diferencias entre cepas de tipo salvaje, mutantes y transformadas. La reproducibilidad, la simplicidad y la alta resolución de esta tecnología la hacen. posible se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación para el análisis integral de cepas mutantes y transformadas y funciones genéticas.
1.3.1.3 Tecnología de análisis de secuencia de ADN (ITS)
La aparición de herramientas moleculares. en la clasificación de hongos ha llevado a los investigadores a utilizar El sistema de clasificación de Trichoderma basado en la morfología fue revisado a mediados de la década de 1990. G.J Samuels (Beltsville, MD, EE. UU.), T. Borner (FRG Berlín) y C.P. lidera la revisión del grupo Longibrachiatum adoptado por Bissett. Las técnicas incluyen varias técnicas de marcadores moleculares (análisis de secuencia ITS1 e ITS2, RAPD), caracterización fisiológica (análisis de isoenzimas) y fenotípica y, por primera vez, posibles tipos de sexo que incluyen este grupo de Trichoderma. Se han estudiado especies (Kuhls et al., 1996, 1997; Samuels, 1996; Samuels et al., 1998; Turner et al., 1997. Los resultados indican que el grupo de helechos braquiales largos es filogenéticamente independiente e incluye 10 taxones). , 4 de los cuales son pares asexuales-sexuales: H.schweinitzii/T.citrinoviride, H.pseudokoningii/T.pseudokoningii, H.jecorina/T.reesei y H.orientalis/T.longibrachiatum Los grupos de Trichoderma de rama larga son grupos más pequeños dentro. el género Trichoderma y están relacionados más lejanamente con otros grupos
Cuando se estudian grupos más grandes de especies de Trichoderma, la relación entre las características morfológicas y la filogenia molecular se vuelve evidente Kindermann et al. Intentaron analizar la filogenia de Trichoderma, utilizando el método de análisis de secuencia de la región ITS1 del ADNr y descubrieron que el grupo Pachycystis es en realidad un grupo o taxón colateral. Este resultado fue confirmado por estudios posteriores de múltiples genes (Kurnig-Gradinger et al., 2002; Chaverri et al., 2003b) demostraron que el clado de Trichoderma viride es al menos otra especie, Aspergillus. Se incluyó y se descubrieron varias otras rutas evolutivas. Dodd et al. (2003) también encontraron que el clado debería dividirse en varias unidades taxonómicas. Lieckfeldt et al. (2001) utilizaron el análisis de secuencia ITS para determinar la posición filogenética de Trichoderma chrysanthemi, que es independiente dentro de Trichoderma y se distingue de otras especies por su tasa de crecimiento muy lenta. Chaverri et al. (2001) descubrieron la etapa sexual del Trypanosoma verde y la caracterizaron utilizando secuencias ITS y tef-1. Los resultados muestran que la relación entre Trichoderma y su etapa sexual puede confirmarse por medios moleculares, y se cree que esta especie está estrechamente relacionada con H. lixi (T. harzianum).
1.3.1.4 Tecnología de investigación poligénica (GCPSR)
Desde que Taylor et al (2000) introdujeron el concepto de taxonomía de consistencia genética (GCPSR) en la taxonomía molecular de los hongos, muchos genes. Se aplicaron métodos de investigación a la taxonomía de Trichoderma. La investigación de Dodd et al. (2000) demostró que ITS a veces es insuficiente para resolver las relaciones entre taxones estrechamente relacionados, particularmente en la relación entre Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, donde la combinación de los grandes intrones tef-1 y rpb2 es la herramienta más adecuada. , pero no es adecuado para todos los fines de investigación en todos los taxones. Kullnig-gradinger et al. (2002) sintetizaron las secuencias ITS, 28S, mitSSU, tef1 y ech42 para el análisis de más especies, y los resultados respaldaron aún más la clasificación secundaria del grupo Chlamydocetes. Samuels et al. (2002) utilizaron la relación entre las secuencias ITS y tef-1 para diferenciar entre Trichoderma invasans y Trichoderma harzianum, dos bacterias que son difíciles de distinguir bajo el microscopio, pero estos dos taxones todavía se encuentran en Trichoderma harzianum. rama evolutiva
Dodd et al. (2003) descubrieron la etapa sexual de T. atroviride, estudiaron sus características utilizando métodos de análisis de secuencia ITS y EF-1a y distinguieron cuatro ramas subevolutivas, entre las que se encuentra una. restringido a una especie endémica de Nueva Zelanda. Además, se encontró que Trichoderma viride y Trichoderma corningii eran heterogéneos. El H.atroviridis de color verde oscuro también es obviamente diferente del H.muroiana que se descubrió por primera vez en el bambú (antes los dos eran tipos indistinguibles). Chaverri et al. (2003a) confirmaron la relación entre Trypanosoma lycidum y Trypanosoma harzianum utilizando cuatro secuencias. En T.harzianum/H.lixii se pueden distinguir varios linajes, pero no se pueden encontrar caracteres morfológicos para una identificación clara. Lu et al. (2004) continuaron el trabajo de Chaverri et al. (2003a) utilizando secuencias ITS, ech-42 y tef-1, centrándose en especies productoras de conidias blancas. Los resultados de la investigación muestran que Trichoderma polyspora y Trichoderma pilus están estrechamente relacionados con Chaverri y Samuels (2003).
Chaverri et al. (2003c, 2004) utilizaron secuencias de RPB2 y EF-1a para estudiar 40 especies de Hyposclerotiorum con ascosporas verdes. Estas especies no son monofiléticas, pero se cree que todas son especies del núcleo inferior. El nuevo clado descrito incluye Chlorospora, Chlorospora, Heterospora y Gelatinella, mientras que Chrysosporium no está en la base. Holmes et al. (2004) describieron a Trichoderma ovale como un endófito perteneciente a la colección Trichoderma koningensis. El carácter heterogéneo del clado Trichoderma viride se expresa nuevamente en la secuencia tef-1. Kraus et al. (2004) describieron T. brevicom-pactum, que está estrechamente relacionado con Garcinia cambogia y comparte similitudes en las secuencias y características fisiológicas de ITS y tef-1. Aunque esta especie está relacionada con la Garcinia cambogia, sus características morfológicas son más cercanas a las de la Garcinia cambogia, por lo que todavía se considera una especie heterogénea. Esta especie es la única que produce tricotecenos y aramectinas.
Overton (2006) revisó la clasificación de géneros asexuales. H. tartrazina y H. cojín forman un clado distinto, y H. sulphurea es el clado hermano de este clado, H. thiophylla y los protodinoflagelados (ahora los dinoflagelados protistas) farinosa y las algas H. macrophylla evolucionaron de forma completamente independiente. Por lo tanto, la población subnuclear es heterogénea, pero no se puede determinar si estas formas asexuales ocurren naturalmente en el estado original o se derivan posteriormente de la cultura. Entre las especies morfológicas de Trypanosoma consoni, Samuels (2006) dividió 12 especies filogenéticas, las cuales se distribuyen en tres linajes: ① Trypanosoma consoni, Trypanosoma ovum, Trypanosoma consoni de amplia distribución, etc. ② Macrobrachium rosenbergii y Macrobrachium austrianus; ③ Lactobacillus acidophilus stephensi Las tendencias de desarrollo de los sistemas geográficos se reflejan en algunas de las categorías anteriores. Este estudio resuelve la cuestión del estado taxonómico de Tamarix kangii, una importante especie de control biológico.
En 2008, Degenkolb et al. utilizaron tecnología de ramificación de secuencias en las regiones rpb2, tef1, ITS1, 5.8 S e ITS2, combinada con análisis morfológicos y químicos de metabolitos, para establecer una rama evolutiva de Trichoderma brevis. esta rama es la más cercana a la rama evolutiva previamente establecida de Luteus. Los miembros de este clado incluyen T.brevicompactum, T.arundinaceum, T.trrrialbense, T.protrudens e Hypocrea rodmanii. A excepción de H. rodmanii, todos los miembros pueden producir toxinas tricosporenoides Trichoderma harzianum A o Trichodermin, y todos pueden producir antibióticos peptídicos alcohólicos, incluida la alamentina. T. viridesscens se considera un complejo de especies. Jacklitsch et al. (2013) establecieron 12 especies filogenéticas agregando el análisis del gen ATP citrato hidrolasa (acl1) y combinando secuencias de genes tef1 y rpb2: Trypanosoma viridis s.str. complejo
1.3.1.5 Otras técnicas analíticas
Según los tiempos producidos En base a las características de los productos metabólicos se identificó y clasificó Trichoderma. Por ejemplo, Thrane et al. (2001) utilizaron cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para analizar la imagen cromatográfica de toda la matriz cromatográfica. Los resultados de clasificación de 44 cepas de Trichoderma fueron consistentes con los resultados de la clasificación morfológica y el análisis de secuencia de ADNr. Este estudio muestra que los metabolitos secundarios producidos por Trichoderma contienen información suficiente para la clasificación e identificación de Trichoderma. También se ha informado sobre la clasificación del género Trichoderma mediante espectrometría de masas. Respinis et al. (2010) utilizaron espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización y desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) para analizar la huella digital masiva del proteoma o péptidos de Trichoderma y clasificaron 129 cepas de Trichoderma en 8 ramas filogenéticas y 25 especies diferentes. , excepto Saturnisporum y Trichoderma harzianum.