Primero, identificar el nivel de transcripción de genes extraños.
La expresión génica se puede dividir en dos etapas: transcripción y traducción. La transcripción es el proceso de producir ARNm utilizando ADN (gen) como plantilla, y la traducción es el proceso de producción de proteínas utilizando ARNm como plantilla. Detectar la expresión de genes extraños es detectar la producción de ARNm específico y proteínas específicas. Por tanto, la detección de la expresión génica se divide en dos niveles.
Es decir, detectar ARNm específico a nivel de transcripción y detectar proteínas específicas a nivel de traducción. El método principal para la detección del nivel de transcripción es la hibridación Northern, que utiliza ADN o ARN como sonda para detectar cadenas de ARN. Al igual que la hibridación Southern, la hibridación Northern también incluye la hibridación por puntos y la hibridación por transferencia.
RT-PCR (PCR con transcripción inversa) también se puede utilizar para detectar la transcripción y expresión de ADN exógeno en plantas. El principio es utilizar ARN total o ARNm de la planta como plantilla para la transcripción inversa y luego amplificarlo mediante PCR.
Si se obtiene una banda de amplificación de ADNc específica del extracto de ARN total de la célula, indica que el gen extraño ha sido transcrito. Este método es simple y rápido, pero la determinación final de la transcripción de genes extraños debe combinarse con los resultados experimentales de la hibridación Northern.
2. Detección de proteínas expresadas por genes exógenos
Existen tres métodos para detectar proteínas expresadas:
1. Método de detección de reacciones bioquímicas: principalmente mediante reacción enzimática. Para detectar;
2. Método de detección inmunológica: detección utilizando la combinación específica de la proteína objetivo (antígeno) y su anticuerpo. Los métodos específicos incluyen hibridación de proteínas, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) e inmunoprecipitación. /p>
3. Detección de actividades biológicas.
La hibridación occidental consiste en inmovilizar el antígeno separado mediante gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre un soporte sólido (como membrana de nitrocelulosa, membrana NC). Las proteínas de diferentes pesos moleculares tienen diferentes movilidades en geles, lo que puede usarse para determinar la presencia y abundancia relativa de antígenos específicos, o si la proteína ha sido degradada.
Después de la electroforesis de proteínas, transfiérala a una membrana NC, colóquela en una solución de proteína (como albúmina sérica bovina BSA) o de leche en polvo, incúbela para bloquear sitios no específicos y luego incúbela con sitios específicos que contengan radiactivos. marcadores o marcadores enzimáticos. El anticuerpo se hibrida, el antígeno y el anticuerpo se combinan y luego se observan mediante autorradiografía radiactiva o desarrollo de color.
Datos ampliados
La correlación entre exones e intrones durante la expresión no se puede confundir con las definiciones de intrones y exones, pero los exones de los eucariotas no son del todo "obvios" (codifican aminoácidos ). A excepción de los exones de los genes de ARNt y de ARNr, el primer y segundo exón de casi todos los genes estructurales solo codifican aminoácidos en parte de la secuencia de nucleótidos, y algunos exones no codifican aminoácidos en absoluto, como la secuencia de nucleótidos de la G6PD humana. el primer exón del gen.
Se ha descubierto que los exones de un gen pueden ser intrones de otro gen, por lo que esto también es cierto. Tomemos como ejemplo el gen de la amilasa del ratón, que es el mismo gen del hígado y las glándulas salivales. El gen de la amilasa consta de cuatro exones. La amilasa producida en el hígado no retiene el exón 1, mientras que la amilasa en la glándula salival retiene la secuencia de 50 pb del exón 1, pero el exón 2 se corta junto con los dos intrones antes y después de este empalme, el 2 se convierte en un intrón en la saliva. gen de la amilasa.
El mismo gen puede producir diferentes productos génicos en diferentes tejidos, y el mismo gen puede codificar proteínas similares en diferentes tejidos. Este fenómeno se debe al hecho de que los potenciadores de los genes son específicos de cada tejido y pueden unirse a factores específicos de cada tejido en diferentes tejidos. Por lo tanto, el mismo gen producirá diferentes transcripciones y procesamiento postranscripcional en diferentes tejidos.
Además, los genes eucarióticos pueden tener un sitio poli(A), por lo que se pueden producir diferentes pre-ARNm en el extremo 3' en diferentes células, por lo que habrá diferentes métodos de empalme.
Debido a que la mayoría de las transcripciones de genes eucariotas se empalman después de agregar una cola poli (A), en diferentes tejidos y células, diferentes factores interferirán con la poliadenilación y, en última instancia, afectarán el método de empalme.
Enciclopedia Baidu-Expresión genética