Sistemas de expresión para hongos filamentosos, incluido Trichoderma spp. , es un nuevo sistema utilizado para la expresión de genes exógenos en los últimos años. Puede superar las deficiencias de los sistemas de expresión procarióticos que no pueden llevar a cabo modificaciones postraduccionales específicas y tiene una mayor capacidad para secretar proteínas extrañas que Saccharomyces cerevisiae. Por lo tanto, se ha convertido en un sistema importante para la producción de proteínas eucariotas biológicamente activas. Podemos mejorar la eficiencia de la mutación aumentando el número de copias de genes o modificando la estructura de las moléculas enzimáticas, y podemos obtener cepas industriales de alto rendimiento.
El sistema de transformación de Trichoderma es similar al de otros sistemas de transformación de hongos, la mayoría de los cuales son vectores construidos con plásmidos derivados de bacterias. Bajo la acción del polietilenglicol (PEG), sorbitol y cloruro de calcio, el gen diana o fragmento de ADN se introduce en el protoplasto receptor y se obtienen transformantes mediante regeneración y selección. En 1998, De Groot et al. utilizaron el método ATMT para transformar seis hongos filamentosos (incluido Trichoderma reesei) por primera vez y lograron éxito.
Trichoderma reesei es el primer Trichoderma utilizado como biorreactor para la producción de proteínas heterólogas. Se utilizó para expresar quimosina de ternera hace 20 años (Uusitalo et al., 1991) y posteriormente se utilizó para expresar fragmentos de anticuerpos inmunológicamente activos (Nyyssonen et al., 1993).
Trichoderma reesei es el principal productor industrial de celulasas y hemicelulasas. No tóxico e inofensivo, con una fuerte capacidad de secreción de proteínas. La cantidad de proteína exocrina en algunas cepas mutantes puede alcanzar los 100 g/l y tienen un sistema de glicosilación similar al de los mamíferos superiores. Por lo tanto, es un huésped ideal para la expresión de proteínas recombinantes y es muy valorado por empresas de preparación de enzimas de renombre internacional (como Genencor y Novozymes).
La celobiohidrolasa CBH1 de Trichoderma reesei está codificada por un gen de copia única, y su secreción representa del 64% al 80% de las proteínas exocrinas. Por lo tanto, el promotor de CBH1 se utiliza a menudo como un promotor fuerte para expresar proteínas heterólogas. Joutsjoki construyó dos vectores en 1993, uno que contenía el gen de la glucoamilasa P (gamP) de Hormoconis resinae y el otro que contenía el ADNc correspondiente. Ambos vectores se expresaron bajo el control del promotor cbh1 de Trichoderma reesei. Estos vectores se transformaron para reemplazar el gen cbh1 de Trichoderma reesei. En estos dos vectores, el promotor cbh1 está conectado con precisión a la región codificante de la proteína gamP, lo que guía a Trichoderma reesei a secretar glucoamilasa P activa (GAMP). Los resultados muestran que el mejor transformante que contiene gamP cD-NA puede secretar alrededor de 700 mg/l de gamP activo, que es 20 veces la producción de levadura resinosa.
Dong Xinrui et al (2012) lo expresaron con éxito utilizando el método. Promotor fuerte cbh1 del gen de lacasa Pleurotus ostreatus. Los resultados mostraron que la actividad enzimática del líquido enzimático crudo obtenido de la fermentación en matraz agitado fue de 237.438+034 UI/ml, que es el valor más alto reportado actualmente en la literatura nacional y extranjera, y su ciclo de fermentación es 13. La actividad enzimática fue casi 30 veces mayor que la de la cepa inicial Pleurotus ostreatus, y mucho mayor que el nivel de expresión heteróloga más alto de lacasa fúngica en Aspergillus niger, Aspergillus nidulans y Aspergillus oryzae.
Wang et al. (2003) obtuvieron las secuencias promotoras y terminadoras de Trichoderma reesei cbh1 mediante tecnología de PCR y construyeron un fuerte vector de integración de expresión pTRIL utilizando el plásmido pUC19 de E. coli como base. para que las bacterias huésped produzcan proteínas homólogas o heterólogas eucariotas. Se espera que una investigación en profundidad sobre esta base desarrolle el sistema de expresión de Trichoderma reesei en un nuevo sistema de expresión eucariota para expresar proteínas requeridas por los humanos en grandes cantidades y proporcione otra alternativa para la producción de productos genéticos eucariotas.
Cuando se utilizan hongos filamentosos como bacterias huésped para producir proteínas recombinantes, la reducción de la producción de proteasa principal del huésped puede reducir la degradación de proteínas extrañas y, en última instancia, aumentar la producción de proteínas diana extrañas. La práctica ha demostrado que la inactivación del gen principal de la proteasa mediante mutagénesis tradicional o eliminación de genes es el principal medio para evitar la degradación de las proteínas recombinantes. Mattern et al. (1992) utilizaron el mutante de deleción de proteasa de Aspergillus niger obtenido como huésped para expresar proteasa heteróloga extracelular, lo que aumentó en gran medida la secreción de la proteína extraña mutante.
Wang et al. (2004) obtuvieron una cepa mutante de Trichoderma reesei Rut C30M3 con una deleción parcial de la proteasa de una cepa de Trichoderma reesei Rutc303 con alta producción de celulasa mediante mutagénesis química. Su actividad de proteasa extracelular fue mayor que la de su cepa original. es aproximadamente un 74% menor, pero sus características de crecimiento y actividad productora de celulasa son las mismas que las de su cepa original, lo que favorece su uso como cepa huésped en un fuerte sistema de expresión para aumentar la producción de proteínas extrañas y se usa ampliamente.
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Trichoderma spp. Es un hongo con gran potencial de aplicación y producción. Funciones de biodegradación y biotransformación de Trichoderma. Relevante para la capacidad de secretar enzimas como celulasa, glucanasa, quitinasa, lipasa y xilanasa. Se conocen muchas especies de Trichoderma, como Trichoderma harzianum, Trichoderma chrysanthemi, Trichoderma chrysanthemi, Trichoderma koningii, Trichoderma longibranch, Trichoderma viride, Trichoderma pseudocorninii, Trichoderma hamma y Trichoderma reesei. También se descubrió que Trichoderma puede fermentar directamente celulosa o azúcar en alcohol en condiciones anaeróbicas. Su micelio contiene una gran cantidad de partículas de aceite, lo que muestra grandes perspectivas de aplicación en bioenergía. Trichoderma se puede utilizar para producir partículas metálicas de tamaño nanométrico; Trichoderma tiene una gran capacidad para secretar proteínas y es un buen biorreactor de proteínas heterólogas. En resumen, Trichoderma está indisolublemente ligada a la biofabricación industrial y es una de las bioespecies industriales importantes.
En la actualidad, Trichoderma es el método de control biológico más utilizado. Un gran número de experimentos han demostrado que Trichoderma tiene buenos efectos antibacterianos sobre las bacterias del suelo y se han comercializado preparados biológicos. No hay datos que indiquen que Trichoderma sea un patógeno humano. Hjortkjaer et al. (1986) estudiaron la patogenicidad de Trichoderma reesei utilizando ratones, cobayas y conejos, y los datos obtenidos mostraron que Trichoderma reesei no es patógeno. Nevalainen et al. (1994) demostraron que Trichoderma reesei no sólo es una cepa segura para la producción de preparaciones enzimáticas, sino también una cepa huésped segura para la expresión de proteínas heterólogas. Xia Runxi et al. (2012) estudiaron la toxicidad de Trichoderma viride como hongo de biocontrol. Los resultados mostraron que Trichoderma T23 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento, la vitalidad y la calidad del capullo de los gusanos de seda. Las pruebas de seguridad anteriores sientan las bases para la aplicación de Trichoderma en la producción real.
A medida que los científicos analicen los datos del genoma de Trichoderma y exploren los patrones reguladores de los genes y los factores reguladores implicados en la síntesis de diversas proteínas exocrinas, seguramente promoverán una aplicación más amplia de Trichoderma en el campo de la biofabricación.