1. Lavado de cristalería:
Todo tipo de cristalería se debe lavar primero con detergente en polvo, enjuagar con agua limpia, remojar en líquido de lavado durante 24 horas y luego enjuagar con. agua, enjuagar una vez con agua destilada y luego secar en el horno para su uso posterior.
Preparación de la loción: generalmente utilizar 50 gramos de dicromato de potasio, agregar 10 ml de agua destilada, calentar hasta disolver, enfriar y luego inyectar lentamente 90 ml de ácido sulfúrico industrial.
2. Preparación del medio de cultivo:
(1) Composición del medio de cultivo: Los componentes principales incluyen diversas sales inorgánicas (macroelementos y oligoelementos), compuestos orgánicos (sacarosa, clases de vitaminas). , aminoácidos, ácidos nucleicos u otros hidrolizados, etc.), agentes quelantes (EDTA) y hormonas vegetales. También se debe agregar agar al medio sólido para solidificar el medio.
Para los medios de cultivo de uso frecuente, se pueden preparar varios medicamentos en una solución madre de 10 o 100 veces, almacenarse en el refrigerador y luego usarse en proporción.
① Grandes cantidades de elementos: Después de pesar los medicamentos, disolverlos por separado y mezclarlos en secuencia para preparar una solución madre con una concentración de 10 veces. Tomar 100 ml de solución madre por cada 1 ml de. medio de cultivo.
② Oligoelementos: los oligoelementos se utilizan en pequeñas cantidades para mayor precisión y comodidad, a menudo se preparan en una solución madre de 100 o 1000 veces. Al preparar 1 ml de medio de cultivo, tomar 10 ml o 1 ml de la solución madre.
③ Los compuestos orgánicos, como los oligoelementos, se pueden preparar en una solución madre de 100 o 1000 veces. Cuando se usa, se deben tomar 10 ml o 1 ml por cada 1 ml de medio de cultivo.
④ Sal de hierro (agente quelante): Se prepara por separado la sal de hierro, compuesta por 5,57 gramos de sulfato ferroso y 7,45 gramos de tetraacetato de etilendiamonio disódico, disueltos en 1 ml de agua. Cada preparación son 1 tomar 5 ml. del medio de cultivo.
⑤Fitohormonas: las fitohormonas generalmente se formulan en una solución de 0,1 a 0,5 mg/ml. Dado que la mayoría de las hormonas vegetales son difíciles de disolver en agua, se pueden utilizar los siguientes métodos:
Ácido naftalenacético (NAA): se puede disolver en agua caliente o disolverse primero en una pequeña cantidad de alcohol al 95 % y Luego se agrega agua hasta una cierta concentración.
Ácido indolbutírico (IBA): Primero disolver con una pequeña cantidad de solución de NaOH al 0,4%, luego añadir agua hasta una concentración determinada.
Ácido indol acético (AIA): Primero disolver en una pequeña cantidad de alcohol al 95%, luego añadir agua hasta una concentración determinada.
2. Primero disuelva 4-D en una pequeña cantidad de solución de HCl al 3,65% y luego agregue agua hasta alcanzar una cierta concentración.
Citoquininas: la 6-bencilpurina (6-BA) y la cinetina (KJ) deben disolverse primero con una solución de HCl al 3,65 % o de NaOH al 0,4 % y luego añadir agua hasta una determinada concentración.
Las diversas soluciones madre preparadas anteriormente o las diversas soluciones medicinales preparadas individualmente deben conservarse en nevera entre 2 y 4 °C para evitar el deterioro o la contaminación microbiana. La sacarosa y el agar del medio de cultivo se pueden pesar según sea necesario.
(2) Fórmula del medio: El éxito del cultivo de tejidos vegetales depende en cierta medida de la elección del medio. Debido a las diferentes cantidades de sales inorgánicas contenidas en los diferentes medios de cultivo, las reacciones de los materiales experimentales también son diferentes. El medio comúnmente utilizado para el cultivo de tejidos vegetales es el medio MS. Para el uso de sales de hierro, excepto el medio que utiliza 10 mg de citrato férrico/ml, el resto del medio de cultivo utiliza solución madre de sal de hierro de 5 mg/ml.
Tabla 6-13 Componentes nutricionales de los medios de cultivo de uso común (unidad: mg/kg)
Componentes nutricionales de los medios de cultivo de uso común (unidad: mg/kg) (continuación)- 1
(3) Procedimiento de preparación del medio de cultivo: al preparar el medio de cultivo, primero extraiga varias soluciones medicinales en secuencia según la cantidad requerida y mézclelas. Disuelva la sacarosa en el agar derretido, luego inyecte la solución mezclada, revuelva uniformemente, ajuste el pH con una solución de NaOH al 0,4 % o de HCl al 3,65 % y luego colóquela en un recipiente de cultivo, como un matraz Erlenmeyer, usando papel de seda o pergamino. Selle bien el recipiente y envuélvalo. Finalmente, coloque el medio de cultivo empaquetado en un autoclave para su esterilización. Generalmente, se usa una presión de 1,1 kg/cm para la esterilización y la esterilización durante 15 a 20 minutos. Sáquelo y enfríelo para que se solidifique antes de su uso. Se deben etiquetar los diferentes medios antes de la esterilización para evitar confusiones.
Nivel de preparación del medio de cultivo
3. Inoculación:
Comparación de los efectos de los desinfectantes comúnmente utilizados
Para obtener materiales estériles, inoculación El material vegetal debe esterilizarse antes de su uso. Generalmente se utilizan reactivos químicos para la desinfección de superficies.
La selección de reactivos y la duración del tratamiento están determinadas por la sensibilidad del material vegetal a los reactivos, y se deben seleccionar reactivos que sean fáciles de eliminar después de la desinfección para evitar la fitotoxicidad y afectar la aparición de tejido en curación. Los desinfectantes comúnmente utilizados incluyen blanqueador en polvo (hipoclorito de calcio), antiformina (hipoclorito de sodio), cloruro de mercurio, etc. (Tabla 6-14). Antes de colocar desinfectante en el material, enjuáguelo con agua del grifo o enjuáguelo primero con alcohol al 70%, lo que ayudará a que el desinfectante penetre en el material vegetal y mate los microorganismos. Después de colocar el desinfectante para desinfectarlo, se debe enjuagar cuidadosamente varias veces. con agua esterilizada y luego vacunar. Debido a los diferentes tipos de plantas y a los órganos o tejidos vegetales seleccionados, la secuencia y el tiempo de desinfección también son diferentes.
El tamaño y la forma del material vegetal (explante) utilizado para la inoculación no está estrictamente limitado, pero no puede ser demasiado pequeño, ya que será difícil que se produzca la división celular si es demasiado pequeño. Por lo tanto, generalmente se requiere que el tamaño de las piezas de corte sea apropiado. Todo el proceso de vacunación debe realizarse en condiciones estériles. Actualmente, todo se hace en una mesa de trabajo limpia y los materiales vegetales se pueden insertar en el medio de cultivo.
4. Cultivo:
El cultivo de tejidos vegetales, al igual que las plantas cultivadas, también se ve afectado por diversas condiciones ambientales como la temperatura, la luz y el pH del medio de cultivo. estrictamente controlado durante la cultura de la habitación. Debido a los diferentes tipos de plantas, partes de materiales vegetales tomados, etc., las condiciones ambientales requeridas también son diferentes. Generalmente, la sala de cultivo se mantiene a una temperatura constante de 25 ± 2 °C. El crecimiento del cultivo se estancará si es inferior a 15 °C y será perjudicial para el crecimiento si es superior a 35 °C. C. La intensidad de la luz es de 2000 lux y el tiempo de iluminación es de 10 a 12 horas; la humedad generalmente no se controla porque la humedad en el recipiente que contiene el medio de cultivo básicamente puede cumplir con los requisitos. Una humedad demasiado alta en el ambiente externo puede causar contaminación fácilmente. ; el pH del medio de cultivo en el cultivo de tejidos suele ser de 5,5 a 6,5. Un pH inferior a 4,0 y un pH superior a 7,0 son perjudiciales para el crecimiento. Para cultivar diferentes plantas, diferentes medios de cultivo requieren diferentes requisitos de pH.
Para un cultivo exitoso de tejidos vegetales, es extremadamente importante elegir un medio de cultivo adecuado. El crecimiento, la diferenciación y el enraizamiento del tejido en curación dependen del contenido de cinetina y auxina en el medio de cultivo. Demasiado alto o demasiado bajo no favorece el crecimiento.
La secuencia de las plántulas de cultivo de tejidos es:
5. Trasplante:
La supervivencia de las plántulas de cultivo de tejidos después del trasplante es la última en obtener un gran número de Las plántulas de cultivo de tejidos a menudo se pierden debido a un trasplante inadecuado. Por lo general, las plántulas de probeta se pueden trasplantar después de que tengan de 3 a 5 raíces. Sin embargo, las plántulas que han sido cultivadas en condiciones estériles en botellas durante mucho tiempo deben pasar por una etapa de transición antes de ser trasladadas directamente al exterior. Antes del trasplante, las plántulas del tubo de ensayo se pueden abrir primero, colocarse en un lugar bien iluminado con condiciones de cultivo similares y ejercitarse durante 3 a 5 días para adaptarse al medio ambiente antes del trasplante. Al trasplantar, lave el agar de las raíces con agua limpia y luego plántelo en una maceta. La tierra de plantación puede ser arena gruesa, vermiculita o perlita con buena ventilación, para mantener la temperatura se puede cubrir con una película plástica. que se puede mantener en el interior durante 10 a 30 días, en unos días se puede trasladar al campo para que crezca normalmente. El cambio de plántulas de cultivo de tejidos a plántulas en macetas es una de las claves para el éxito de las plántulas de cultivo en grupo. Por lo tanto, se deben controlar la temperatura, la humedad y la luz. Varias plantas tienen diferentes requisitos de condiciones ambientales y deben tratarse de manera diferente.