(1. Laboratorio estatal clave de biología patógena de enfermedades del ganado, Instituto de Medicina Veterinaria de Lanzhou, Academia China de Ciencias Agrícolas, Lanzhou 730046, Gansu; 2. Ganadería e Investigación Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas y Ganaderas, Instituto de la Región Autónoma del Tíbet, Lhasa, Tíbet 850000)
Resumen: La tecnología genética inversa es una nueva tecnología de biología molecular que es útil para el estudio en profundidad de la La estructura y función del genoma de los virus de ARN de cadena negativa, la exploración de la replicación y transcripción de su genoma y el desarrollo de nuevas vacunas genéticamente modificadas desempeñan un papel importante. Este artículo presenta el mecanismo de replicación y las características de los virus de ARN de cadena negativa segmentados y no segmentados, analiza las estrategias para la investigación de genética inversa en estos virus, los últimos avances en investigación y los principales factores que afectan la eficiencia del rescate, y además involucra a la cadena negativa. Vectores de virus ARN y tendencias de investigación de sus virus recombinantes. Por lo tanto, a través de la genética inversa, las personas comprenderán mejor los virus de ARN de cadena negativa, sentando las bases para la utilización científica y el control eficaz del virus.
Palabras clave: genética inversa; virus de ARN de cadena negativa; huésped de la enfermedad
Como nueva tecnología, la tecnología de genética inversa produce virus de ARN infecciosos a partir de ADNc clonado. virus a nivel de ADNc, proporcionando así un medio poderoso para el estudio de genomas funcionales virales. En términos relativos, esta tecnología es más fácil de usar para virus de ARN de cadena positiva y su genoma puede manipularse desde el nivel de ADNc para rescatar virus infecciosos. Virus de ARN de cadena negativa (NS), como el virus del Ébola, el virus de Marburg, el hantavirus, el virus de Lassa, el virus de la fiebre hemorrágica del Congo, etc. , por sus características biológicas únicas, trae ciertas dificultades al rescate del virus. Además, las enfermedades que provocan se caracterizan por una elevada morbilidad y mortalidad, por lo que el estudio de los virus de ARN de cadena negativa resulta especialmente importante. En la actualidad, se ha aplicado tecnología de genética inversa al estudio de dichos virus, lo que ha tenido un profundo impacto en la estructura y función, el mecanismo de regulación de la expresión y la patogénesis de estos genomas virales.
1 Mecanismo de replicación de los virus de ARN de cadena negativa
Existen 7 familias virales de virus de ARN de cadena negativa [1], a saber, las familias Rhabdoviridae, Paramyxoviridae y Filovirus, Bornaviridae, Orthomyxoviridae , Lepoviridae y Botulinumviridae. Entre ellos, los primeros cuatro virus son virus de ARN monocatenario de cadena negativa sin segmentos, y los últimos tres virus son virus de ARN de cadena negativa segmentados, que contienen de 6 a 8, 3 y 2 segmentos de ARN de cadena negativa respectivamente.
Los virus de ARN de cadena negativa (SNS) segmentados y los virus de ARN de cadena negativa (NNS) no segmentados tienen las mismas características. Son virus envueltos que se replican en el citoplasma y producen ARNm sin empalme. A excepción de Orthomyxoviridae y Bornaviridae, su transcripción y replicación se llevan a cabo en el nucléolo y algunos ARNm también requieren corte y empalme. Para la cadena de sentido tradicional de ARNm, el ARN del genoma del virus de ARN de cadena negativa y el genoma "complementario" están envueltos por una cápside de nucleoproteína (N o NP) y se transcriben juntos * * * para formar una plantilla de N-ARN simétrica helicoidal que combina diferentes cantidades de proteínas Polimerasas (proteína L grande y fosfoproteína P de paramixovirus, rabdovirus y bornavirus, L, VP30 y VP35 de filovirus y virus del Ébola). PA, PB1 y PB2 del virus de la influenza se combinan para formar un complejo mínimo de iniciación de replicación (también conocido como complejo de ribonucleoproteína, RNP). Una vez que se forma un complejo RNP funcional, comenzará la transcripción, replicación y multiplicación viral.
El virus de ARN de cadena negativa se une al receptor de la célula huésped a través de la glicoproteína en la superficie de su partícula viral, y luego la envoltura del virus contacta con la membrana plasmática (vía independiente del pH) o la membrana endosómica. fusión de la membrana (vía dependiente del pH) y luego libera el complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) en el citoplasma. El complejo RNP está compuesto por ARN viral, nucleoproteína (ARN viral que encapsula) y complejo de polimerasa viral. Durante el proceso de transcripción, la ARN-ARN polimerasa transportada por el virus primero transcribe el ARNm del genoma viral (-ARN) y luego lo traduce para producir las enzimas y proteínas estructurales necesarias. Durante el proceso de replicación, se transcribe ARN con la misma longitud que el genoma viral, que puede usarse como plantilla para sintetizar ARN viral.
La mayoría de los virus de ARN de cadena negativa se replican en el citoplasma de las células infectadas, mientras que los bornavirus y los ortomixovirus se replican en el núcleo, por lo que para estos últimos, el complejo RNP y las proteínas NP y polimerasa recién sintetizadas deben transportarse al núcleo, donde se sintetizan las proteínas recién sintetizadas. El complejo RNP se transporta desde el núcleo al citoplasma, de modo que el complejo RNP recién sintetizado se puede ensamblar con las proteínas estructurales del virus en la membrana plasmática o en la membrana del complejo de Golgi, y luego se puede liberar el virus recién sintetizado.
La diferencia evidente entre los virus SNS-RNA y los NNS-RNA radica en sus mecanismos de replicación y transcripción de mRNA. Cada segmento del virus SNS representa una unidad independiente de transcripción y replicación. Los nucleótidos en los extremos 3' y 5' de cada segmento se conservan, mostrando una complementariedad inversa parcial, lo que resulta en la formación de un promotor central funcional en los extremos del par de bases. La replicación comienza con el genoma (vRNA) y el genoma "complementario" (cRNA). Para los virus NNS, su transcripción comienza sólo en la plantilla de ARNv. Los que no obedecen esta regla son los arenavirus y algunos virus Buniviridae [2].
Estrategias de investigación para la tecnología genética inversa de virus de ARN de cadena negativa
Ya sea desde la perspectiva del ADNc o del ARN sintético, el rescate de virus de ARN de cadena negativa es diferente al de los virus positivos. Virus de ARN de cadena negativa en los siguientes aspectos: (1) La replicación de virus de cadena negativa requiere la síntesis de proteínas de novo, y la síntesis de proteínas de novo se ve afectada por su propia ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); en el genoma y el genoma "complementario". Necesita ser encapsulado por la cápsida de nucleoproteína viral para que sirva como una cadena plantilla funcional para estimular la transcripción/replicación. No obstante, se han obtenido clones moleculares infecciosos de algunos virus de ARN de cadena negativa, como el virus de la rabia, el virus de la peste bovina y el virus de la enfermedad de Newcastle, mediante varias estrategias y se han manipulado in vitro a nivel de ADN, incluida la eliminación genética, según diferentes fines de investigación. . deleción, deleción de genes, inserción de genes, reemplazo de genes y construcción de virus quiméricos.
Para obtener virus infecciosos de ARN de cadena negativa a partir de clones de ADNc, es necesario establecer un sistema de microrreplicación para invertir el nuevo ARN y procesar secuencias posteriores. En este sistema, la ARN polimerasa T7 se usa a menudo para sintetizar ARN viral de cadena negativa utilizando el ADNc del genoma viral como plantilla, y luego este ARN viral artificial se transfecta en células eucariotas infectadas por el virus auxiliar, obteniendo así ARN artificial. virus. Utilizando este sistema, se preservaron con éxito varios genes informadores del genoma pequeño, como el virus Sendai (SEV) y el virus respiratorio sincitial (RSV).
Preservar el ADNc infeccioso de longitud completa es un proceso muy complejo y de alta tecnología. Antes de obtener ADNc mediado por virus infecciosos, es necesario construir minigenomas funcionales de virus NNS y SNS [3]. Hay una serie de factores que determinan el éxito o el fracaso de un rescate. Los virus de ARN de cadena negativa suelen tener un marco de lectura abierto con un gen informador cerca del extremo no codificante. Son secuencias candidatas muy útiles en la construcción de virus recombinantes infecciosos, incidiendo en el éxito o fracaso del rescate del virus. El promotor T7 de tipo salvaje controla la eficiencia del rescate. Cuando se elimina la secuencia del promotor T7, se mejorará la eficacia de rescate de la mayoría de los virus. Por ejemplo, el extremo 5' de la ribozima del virus de la hepatitis delta se autoescinde para producir un extremo viral 3' preciso, y se mejorará la eficiencia del rescate. El punto más profundo es que para que la mayoría de los genomas o análogos de los paramixovirus sean funcionales, deben obedecer seis reglas, y la replicación eficiente de la mayoría de los paramixovirus sólo se puede observar cuando su número total de nucleótidos es divisible por seis. Según la “regla de los seis” [4], las proteínas de ácido nucleico interactúan con exactamente seis nucleótidos. Para expresar T7, algunos científicos han utilizado vectores de expresión controlados por elementos potenciadores/promotores de CMV o promotor de β-actina de pollo y líneas celulares que expresan establemente la polimerasa T7 como alternativas, pero los resultados no fueron ideales. Recientemente, el uso de la ARN polimerasa I (POL II) supera la mayoría de las deficiencias del sistema de cebado T7.
Yanai H et al[5] utilizaron el promotor RNA Pol en un sistema genético inverso para estudiar la eficacia de la expresión del genoma pequeño del virus Borna y descubrieron que insertar la secuencia de ácido nucleico SV40 en Pol ⅱ puede mejorar eficazmente la expresión del genoma pequeño en Las células que carecen del antígeno SV40 T se copian.
El rescate de los virus NNS y SNS aún debe basarse en la construcción del genoma "complementario". En 1994, los virus NS RNA (baculovirus y virus de la rabia) fueron rescatados con éxito por primera vez. Un factor clave en el éxito de este método es la síntesis de ARN genómico "complementario" de cadena positiva a partir de clones de ADNc. En 2001, se rescató un virus Thogoto de 6 segmentos utilizando sistemas controladores T7 y Pol para la expresión de proteínas y la transcripción de ARNv [6]. Flick R et al. [7] utilizaron ampliamente el sistema Polⅰⅰ basado en el sistema de rescate de genoma pequeño (CCHF, Uukuniemi, Hanaan, Borna virus y otros virus de conejos) es necesario confirmar más.
3 Aplicación del sistema de genética inversa
3.1 Virus de ARN NS
La investigación en genética inversa ha ampliado nuestra comprensión de la biología molecular y la patogénesis de los virus de ARN. Comprensión mecanicista. Para controlar el ciclo de vida de los virus, el estudio de los minigenomas es particularmente importante, incluida la ubicación de los elementos que responden a cis, la estructura secundaria de la región promotora, la región funcional de los factores que actúan en trans, la fuerza relativa del genoma y iniciación del genoma "complementario". Zi et al. El análisis genético inverso se ha aplicado con éxito a la determinación e identificación de elementos que actúan en cis de los virus de ARN. Los estudios de los pequeños genomas de los virus NNS y SNS han demostrado que los elementos que actúan en cis y que controlan la transcripción, replicación, capsidación y empaquetado se encuentran en las secuencias de nucleótidos no codificantes 3' y 5'. La interacción entre los 12 y 13 nucleótidos al final de cada segmento del virus de la influenza constituye el promotor central básico que afecta la proliferación del virus, y los nucleótidos no codificantes adyacentes tienen la mejor eficiencia de replicación. Li Z et al. [8] utilizaron tecnología genética inversa para construir un virus de influenza aviar recombinante, insertando 1 gen en DKGX/22 (no patógeno) y 7 genes en DKGX/35 (fragmento altamente patógeno). Tras la inoculación en ratones, los resultados confirmaron que el aminoácido en la posición 701 de PB2 era una parte muy importante de los animales infectados.
Estudiar el mecanismo por el cual las polimerasas homólogas seleccionan/reconocen el ARN es particularmente difícil debido a la falta de comprensión de la estructura del promotor. No se sabe si la sustitución de nucleótidos básicos en elementos promotores altera la estructura esencial del ARN o afecta la reacción específica de nucleótidos preferenciales entre el molde y la polimerasa. A pesar de estas deficiencias, mediante análisis específicos de los promotores del virus de la influenza A, se ha entendido esencialmente la estructura interna de la cadena y el mecanismo de reacción entre la plantilla y la polimerasa necesarios para iniciar la replicación viral. Basándose en el mecanismo de sustitución de nucleótidos, Flick y sus colegas describieron una conformación "helicoidal" única de la región de iniciación del ARN viral, que incluye una estructura de varilla de 6 pares de bases ubicada distalmente y una estructura de bucle de tallo de dos pares de bases intracadena. La mutagénesis de sustitución simple y complementación doble reveló que los nucleósidos estructuralmente invariantes son raros y, por lo tanto, es extremadamente importante mantener la integridad estructural de esta región. Este nucleósido invariante está ubicado en una estructura de anillo de tetranucleótido. Posiblemente contribuyendo a la reacción con la proteína del complejo polimerasa, estudios recientes y previos también han confirmado la conformación de "sacacorchos" [9], que es más compleja que el modelo de iniciación del virus esperado anteriormente, con un mango de tetera y una estructura similar a un tenedor.
3.2 Vectores de virus recombinantes
Las características biológicas especiales de los virus de ARN de cadena negativa los convierten en los vectores más prometedores: ① La replicación no puede estar mediada por el ADN, por lo que el genoma de los virus de ARN lo hará no integrarse en el genoma del huésped; ② La mayoría de los miembros de esta clase de virus pueden producir títulos de virus más altos; ③ Pueden acomodar genes extraños y expresar proteínas o polipéptidos en niveles altos; ④ Los virus de ARN de cadena negativa pueden estimular al huésped como vectores; inmunidad celular e inmunidad humoral.
El virus recombinante puede expresar de forma estable material genético extraño, generando así nuevos conceptos de tratamiento y modelos de prevención y control de enfermedades [10]. Para la inserción estable de material genético extraño son especialmente adecuados los paramixovirus y rabdovirus.
Estos virus pueden contener y expresar material genético extraño de hasta 5 kb de tamaño, lo que permite crear vacunas bivalentes o incluso polivalentes. Además, es bastante fácil insertar otras unidades de transcripción después de que los otros genes hayan terminado e introducido la señal inicial, y la elección precisa del sitio de inserción final controla el nivel de expresión de este gen insertado. Los virus recombinantes se utilizan ampliamente como vectores, como los virus de la vacuna contra el sarampión, que tienen un largo historial de seguridad en vacunas atenuadas. Otros virus, como los virus de las vacunas SEV y VSV, se consideran no patógenos para los humanos porque sus ciclos de vida se limitan al citoplasma, por lo que no hay peligro de transporte y se han utilizado ampliamente como vectores.
3.3 Investigación sobre virus recombinantes en vacunas
En la producción de vacunas atenuadas mediante virus recombinantes, se pueden producir algunas secuencias mutantes insertando algunas secuencias de mutación en la vacuna o cepa de tipo salvaje. [11] Para las vacunas, estas secuencias mutantes pueden inducir que múltiples sitios de reconocimiento sean reconocidos por una única enzima especial, debilitando así la toxicidad y logrando el propósito de desarrollar vacunas. La virulencia de algunos virus recombinantes atenuados está relacionada con el cambio o la eliminación de genes antagonistas del interferón no estructurales. Por lo tanto, los virus modificados tienen una virulencia debilitada debido a la reducción o incapacidad de prevenir la influencia de los interferones del huésped [12] y el reordenamiento. de genes también hará que la virulencia se debilite. Veits J et al. [13] construyeron un virus de la enfermedad de Newcastle que puede expresar la hemaglutinina del virus de la influenza aviar del subtipo H5 mediante genética inversa e insertaron un gen abierto entre su gen de fusión y el gen de hemaglutinina-neuraminidasa que codifica el marco de lectura aviar altamente patógeno. Hemaglutinina del virus de la influenza. Como resultado, el recombinante puede expresar hemaglutinina en niveles elevados, por lo que se cree que el recombinante puede usarse como vacuna bivalente contra el virus de la enfermedad de Newcastle y la influenza aviar, y también puede usarse para controlar la influenza aviar. Webster RG et al. [14] aplicaron genética inversa para construir el virus de la influenza aviar H5N3 altamente activo. Cuando el contenido de proteína HA en la vacuna en emulsión de aceite de Qinghuo alcanza 0,015 ng ~ 1,2 ng, los patos pueden proteger eficazmente el virus de la influenza aviar H5N1.
3.4 Otras aplicaciones de los virus recombinantes
Los virus recombinantes también se utilizan en otros campos, como la prevención, el tratamiento y la investigación. Una de las áreas de investigación más candentes actualmente es el estudio del potencial anticancerígeno de algunos virus NS RNA, especialmente VSV. En comparación con otros virus, tiene algunas ventajas como agente anticancerígeno, como estar modificado para contener genes que regulan las respuestas inmunitarias y una caja suicida, aumentando así su capacidad anticancerígena [15]. Además, se han utilizado pseudovirus para reemplazar virus altamente patógenos. Por ejemplo, la eliminación del gen G de mutantes de VSV puede detectar el estado de unión de este receptor viral. De manera similar, el uso de un VSV pseudotipado con proteínas de la envoltura del virus Hantaan o Seúl como un sustituto eficaz del virus completo proporciona un método analítico seguro y confiable para el estudio del virus Hantaan [16]. El paramixovirus recombinante también puede tener cierto valor de investigación en terapia génica porque tiene varias ventajas obvias en comparación con los vectores retrovirales y adenovirales tradicionales. Por ejemplo, en células fragmentadas (células neuronales), los vectores SeV se utilizan para expresar eficazmente genes extraños [17]. Después de que los genes mediados por los vectores SeV con capacidades de replicación se transfieren a células epiteliales de pulmón de ratón, aún se pueden expresar de manera efectiva.
4 Conclusión
Debido a la aplicación de la tecnología genética inversa, la investigación sobre virus de ARN ha aumentado exponencialmente, lo que proporciona nuevos conocimientos sobre la biología y patogénesis de los virus de ARN de cadena negativa que podrían El mecanismo no se ha estudiado antes y abre la puerta al desarrollo de vacunas atenuadas para virus de ARN de cadena negativa. Sin embargo, también generó algunas preguntas y generó datos controvertidos, algunos de los cuales estaban relacionados con diferentes virus o sistemas experimentales, o tal vez porque aún no entendíamos completamente los mecanismos, algunas de las preguntas se pensaban que habían sido bien abordadas; , recientemente han surgido nuevos problemas y situaciones. Se ha informado que la señal de empaquetamiento del virus de la influenza A se ha extendido a la región codificante de este virus, lo que indica que aunque los virus de ARN NS pueden promover eficazmente la transcripción, replicación, capsidación y empaquetamiento [18], no se pueden excluir otras mejoras/regulaciones. señales para estas funciones. En principio, la transcripción y la replicación comienzan desde el extremo 3' cerca del promotor. Un nuevo estudio de VSV refuta esta idea. Dicen que el ARN líder no se transcribe antes, que la transcripción comienza desde el sitio de inicio interno del gen N, etc.
Por lo tanto, la investigación en esta área todavía enfrenta desafíos y aún queda mucho trabajo por hacer. Hay motivos para creer que a medida que la tecnología de genética inversa continúe profundizando la investigación sobre los virus de ARN de cadena negativa, estos problemas se resolverán científicamente y el control de los virus de ARN de cadena negativa ya no estará muy lejos.