El efecto in vitro de células dendríticas transfectadas con ARN total de células HepG2 marcadas con GFP
Resumen Objetivo: Explorar el uso de fluorescente verde proteína como marcador Observar la viabilidad de células dendríticas transfectadas con ARN total de células tumorales y la viabilidad de células dendríticas transfectadas como posibles vacunas inmunoterapéuticas. Métodos: El plásmido pGFPC3 se transfectó de forma estable en células HepG2. Se utilizó trizol para extraer el ARN total de HepG2GFP. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer de hígado para inducir células dendríticas y se transfectó el ARN total. El efecto de transfección se observó con un microscopio de fluorescencia, los cambios fenotípicos se detectaron con citometría de flujo y los cambios en la secreción de IL12 en los sobrenadantes de células dendríticas se detectaron mediante ELISA. Se utilizó el ensayo MTT para detectar el efecto citotóxico de los CTL. Resultados: La GFP se expresó de manera estable en células HepG2GFP y mostró fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia. Las células dendríticas transfectadas con ARN total de células HepG2GFP también se expresaron de manera estable. Después de la transfección, la expresión de moléculas de membrana como CD80 (13,2 % a 86,7 %), HLADR (38,9 % a 97,9 %), CD83 (0,9 % a 97,1 %), CD86 (31,2 % a 92,5 %) aumentó significativamente y la sobrenadante La secreción de IL12 aumentó significativamente [61,3 ± 8,10000001]. Los CTL activados por células dendríticas transfectadas con ARN total de GFP de HepG2 mostraron una lisis eficaz y específica de las células HepG2. Conclusión: La GFP se puede utilizar como marcador para observar el efecto de la transfección de ARN total de células tumorales en células dendríticas. Las células dendríticas transfectadas con ARN total de células tumorales pueden servir como una vacuna inmunoterapéutica prometedora.
Células dendríticas; proteína verde fluorescente; transfección de ARN
Objetivo: Explorar el uso de la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador para observar células dendríticas transfectadas con ARN del carcinoma hepatocelular (HCC). (DC) y la viabilidad de transfectar el ARN de células tumorales en DC para preparar vacunas. Métodos: El vector de partículas de proteína fluorescente verde PGPFPC 3 se transfectó de manera estable en HCC HepG2 y el ARN total de HepG2GFP se extrajo mediante el método Trizol. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de pacientes con cáncer de hígado para inducir células dendríticas in vitro y el ARN total se transfectó en células dendríticas. El efecto de la transfección se observó bajo un microscopio de fluorescencia y los cambios fenotípicos de las células dendríticas antes y después de la transfección se detectaron mediante citometría de flujo. Se utilizó el método ELISA para detectar los cambios en IL12 en el sobrenadante antes y después de la transfección. El ensayo MTT detecta la tasa de destrucción de células diana por parte de células efectoras. Resultados: Después de transfectar de manera estable PGPFPC 3 en células HepG2, se pudieron obtener células HepG2 que expresaban GFP de manera estable, que mostraron fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia. Bajo el microscopio de fluorescencia de las CD, las células transfectadas con ARN total mostraron fluorescencia verde para CD80 (aumentó del 13,2 % al 86,7 %), HLADR (aumentó del 38,9 % al 97,9 %), CD83 (aumentó del 0,9 % al 97,1 %) y CD86. (31.2). Los CTL inducidos pueden matar específicamente las células HepG2. Conclusión: La GFP se puede utilizar como marcador de observación para células dendríticas transfectadas con ARN de células tumorales, y las células dendríticas transfectadas con ARN de células tumorales se pueden utilizar como una vacuna tumoral eficaz.
Células dendríticas; proteína verde fluorescente; transfección de ARN
Figura china No. R739.41
0 Introducción
Carcinoma de hepatocitos (CHC) ) es un tumor maligno común. Sólo un pequeño número de pacientes son aptos para el tratamiento quirúrgico, la tasa de recurrencia es alta y el pronóstico es malo, lo que amenaza gravemente la salud humana [1]. Las DCS (células dendríticas) son poderosas células presentadoras de antígenos profesionales en el cuerpo. Puede captar y procesar antígenos de manera eficaz y presentar los polipéptidos procesados a las células T en reposo, provocando respuestas inmunitarias específicas contra los antígenos [2]. En estudios similares, nacionales y extranjeros, no existen indicadores claros que permitan observar el efecto de la transfección de células dendríticas con ARN tumoral. Utilizamos el vector de partículas de proteína fluorescente verde pGFPC3 para transfectar de manera estable la célula de cáncer de hígado HepG2 y extrajimos el ARN total de GFP de HepG2 seleccionado para transfectar células dendríticas. Observe la expresión de proteína verde fluorescente, marcadores de superficie específicos y moléculas funcionalmente relacionadas en células dendríticas transfectadas, y detecte la secreción de citocinas en sus sobrenadantes para explorar su viabilidad como vacuna tumoral.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales Las células mononucleares de sangre periférica de pacientes con cáncer de hígado se derivaron de pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas en nuestro departamento. La línea celular de cáncer de hígado HepG2 se subcultivó de forma rutinaria en nuestro departamento. El citómetro de flujo (BD), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas DG3022A (East China Electronic Tube Factory) y el microscopio óptico de fluorescencia XIF (Nicon) están disponibles en nuestro hospital. Los anticuerpos contra FITCCD80, FITCHLADR, PECD83 y PECD86 se adquirieron en BD. RhGMCSF y rhIL4 se adquirieron de Peprorotec; TNFα se adquirió en el Centro de Biotecnología de nuestra escuela; el vector de proteína verde fluorescente PGPFPC 3 fue donado por el Dr. Jia Jun del Shaanxi Cancer Hospital. Lipofectamine 2000, reactivo Trizol de Invitrogen; medio RPMI 1640, suero fetal de ternera, G418 se adquirieron de Gibco y el medio sin suero Xvivo se adquirió de BioWhittaker. El kit ELISA IL12 se adquirió de Bioscience Company. MTT se compró a Sigma.
Método 1.2 De acuerdo con las instrucciones de transfección de 2000, se transfectó PGPFPC 3 en HepG2 y se seleccionó G418 durante 2 meses. Las células seleccionadas se denominaron HepG2 FP y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. El ARN total de HepG2 FP se extrajo con reactivo Trizol y se observó bajo luz ultravioleta. Conservar a -80°C para su uso posterior. El ARN total de HepG2 se extrajo utilizando el mismo método. Se aislaron células madre hematopoyéticas de pacientes con cáncer de hígado mediante el método adherente y las células adherentes se indujeron en CD bajo la acción de las citocinas rhGMCSF y rhIL4. Se utilizaron microscopio invertido y microscopio electrónico para observar la morfología celular y se utilizó citometría de flujo para detectar el fenotipo celular.
1.2.1 Transfectar células dendríticas. Recoger células dendríticas cultivadas durante 4 días, transferirlas a una placa de 6 pocillos, transfectarlas con ARN total de HepG2GFP y establecer un grupo de control en blanco. Incubar durante 48 horas. Observar bajo un microscopio de fluorescencia.
1.2.2 Determinación de la secreción de citocinas Después de 48 horas, recoger los sobrenadantes de las CD de cada grupo y utilizar ELISA para detectar la secreción de IL12 en los sobrenadantes de cada grupo antes y después de la transfección.
Recoge 65438±0,2.3 células dendríticas efectoras CTL de cada grupo. Después de la irradiación con 30 Gy 60Co, las células se mezclaron con las células no adherentes recuperadas en una proporción de 20:1 y se sembraron en una placa de 24 pocillos. Después de 5 días de cultivo, las células recogidas son células efectoras. Se recogieron células HepG2 en fase de crecimiento logarítmico como células diana. Se sembraron células efectoras y células diana en una placa de 96 pocillos en una proporción de 20:1. Configure un único grupo de células objetivo y un único grupo de células efectoras simultáneamente. Después de 24 h de cultivo, se utilizó el ensayo MTT para la detección. Calcule la eficiencia de destrucción de CTL de acuerdo con la siguiente fórmula: [1-(objetivo efectivo A490-célula efectiva A490)/célula objetivo A490] × 65438.
Métodos estadísticos: Utilizar el software estadístico SPSS 10.0 para analizar los resultados.
2 resultados
2.1 El ARN total de HepG2 FP se transfectó en células dendríticas, se transfectó de manera estable y se seleccionó para células HepG2 FP que pueden expresar GFP de manera estable. Todas las células mostraron fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1) y permanecieron sin cambios después de más de 20 pases. En comparación con las células de control, las células modificadas con el gen GFP no tuvieron cambios obvios en la morfología, el crecimiento, etc. La expresión de GFP no es tóxica para las células diana. Después de extraer el ARN total de las células HepG2GFP con Trizol, se tomaron 2 μL de ARN total para electroforesis en gel y se observaron bandas a los 5 s, 18 s y 28 s (Figura 2). Después de que los monocitos se adhirieron a la pared, bajo la acción de las citocinas GMCSF e IL-4, aparecieron colonias de células en el segundo día de cultivo. Sin embargo, después de cinco días, las colonias aumentaron significativamente, se hicieron más grandes y las células tenían forma de rebabas. aparecieron protuberancias. El día 7, las colonias comenzaron a disminuir, lo que resultó en una gran cantidad de células con procesos dendríticos (Fig. 3A, B). Bajo un microscopio de fluorescencia, las células en el grupo de CD transfectadas con ARN total de HepG2GFP mostraron fluorescencia verde, mientras que las células en el grupo transfectado con ARN total de HepG2 y el grupo de control en blanco no mostraron una expresión de fluorescencia obvia (Figura 4A, B, C).
Figura 1 Microscopio de fluorescencia: positividad de fluorescencia citoplasmática de HepG2 después de la transfección estable con PGPFPC 3×250 (omitido).
Figura 2 Patrón de electroforesis de ARN total de células 2 hepg 2 GFP (omitido)
Figura 3 Morfología de las células dendríticas (día 7) (omitido)
2.2 Citometría de flujo mostró que en el día 7 de la inducción del fenotipo celular, la expresión de CD80 en las CD fue del 13,2%, H LADR del 38,9%, CD86 del 31,2% y la baja expresión de CD83 fue de solo el 0,9%. Después de la transfección, la expresión de las moléculas anteriores aumentó significativamente, alcanzando el 86,7% para CD80, el 97,9% para HLADR, el 92,5% para CD86 y el 97,1% para CD83, respectivamente, lo que indica que las células transfectadas tenían las características de células dendríticas maduras.
Figura 4 ARN total transfectado en CD×250 (omitido)
2.3 Método ELISA para detectar el ARN total de HepG2GFP secretado por IL12.
La secreción de IL12 en el sobrenadante del grupo de transfección de CD aumentó significativamente en comparación con antes de la transfección [(287,4 ± 29,3) ng/l frente a (61,3 ± 8,1) ng/l; n = 6, P < 0,05.
2.4CTL media la citotoxicidad del ARN total de HepG2GFP. El efecto citotóxico de los CTL estimulados por DC en células HepG2 fue (62,6 ± 2,9) %, el de las células T estimuladas por DC no transfectadas fue (20,8 ± 65438 ± 0,5) % y el de las células T no estimuladas por DC fue (20,8 ± 65438± 0,5)%. El efecto citotóxico de los CTL estimulados por las CD transfectadas con ARN total en células HepG2 fue significativamente mayor que el de los dos grupos de control (n = 6, P <0,05). La citotoxicidad de los CTL estimulados por las CD transfectadas con ARN total en SMMC7721 y K562. células fue significativamente mayor que el de los dos grupos de control (n = 6, P <0,05). Los efectos son (37,7 ± 65438 ± 0,8)% y (26,8 ± 65438 ± 0,62) respectivamente.
3 Discusión
Las CD son las células presentadoras de antígenos profesionales más poderosas del cuerpo y desempeñan un papel extremadamente importante en la inmunidad de las células T [2]. La preparación de vacunas utilizando células dendríticas sensibilizadas por diversos antígenos tumorales ha sido un foco de investigación en los últimos años [3-8]. En comparación con otros métodos, el ARN total de células tumorales transfectadas con CD tiene las siguientes ventajas: en primer lugar, no está restringido por antígenos tumorales conocidos y puede inducir CTL policlonales; en segundo lugar, el ARN necesario para la transfección se puede obtener mediante amplificación y una pequeña cantidad; Una gran cantidad de muestras de tejido tumoral pueden obtener grandes cantidades de ARN mediante amplificación [8]. Sin embargo, actualmente no existe ningún método en el país ni en el extranjero para observar claramente la eficacia de la transfección de ARN total de células dendríticas. Utilizamos ARN total de HepG2GFP para transfectar CD y utilizamos GFP como marcador para observar la eficiencia de la transfección de ARN total en CD, explorar su viabilidad como vacuna contra tumores y proporcionar una base experimental para el tratamiento clínico del cáncer de hígado.
En este experimento, el citoplasma de DC transfectado con ARN de HepG2GFP mostró fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia, lo que confirma que el ARNm de GFP se puede expresar normalmente en el citoplasma de DC y que el ARN total de células tumorales también se puede expresar en el citoplasma de DC. Expresión de traducción china. Después de la transfección, las expresiones de CD83, CD80, CD86 y HLADR aumentaron significativamente y la secreción de IL12 aumentó significativamente. Los resultados mostraron que la transfección de ARN promovía la maduración de las células dendríticas in vitro. Las células dendríticas maduras presentan antígenos tumorales traducidos y expresados por el ARN total de las células tumorales a los linfocitos T. Los linfocitos T inducidos por esta vía son principalmente linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. En este experimento, el efecto citotóxico de los CTL inducidos sobre HepG2 fue significativamente mayor que el de los linfocitos T de control. Demuestre que los linfocitos T inducidos son específicos del tumor. Por lo tanto, en ausencia de antígenos específicos del cáncer de hígado, la transfección de ARN total de células de cáncer de hígado en CD para preparar vacunas tumorales y la inducción de CTL policlonales dirigidos a células de cáncer de hígado puede convertirse en una dirección de desarrollo para las vacunas de CD contra el cáncer de hígado.
Referencia
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