Cómo hacer un experimento con el gen indicador de luciferasa
(1) Utilice métodos bioinformáticos para analizar y predecir posibles sitios de unión del factor de transcripción en la región promotora.
(2) Diseñar cebadores y utilizar PCR para clonar el fragmento promotor objetivo deseado a partir del ADN genómico e insertar este fragmento en el plásmido del gen indicador de luciferasa (pGL3-basic).
(3) Detectar clones positivos y secuenciarlos. Amplificar el clon y purificar el plásmido para su uso posterior.
(4) Amplificar el plásmido del factor de transcripción y purificarlo para su uso posterior. Al mismo tiempo preparar el correspondiente control de plásmido vacío y purificarlo para su posterior uso.
(5) Cultivar 293 (u otras células diana), inocularlo en una placa de 24 pocillos y dejar crecer durante 10-24 horas (80 confluencia).
(6) Transfectar células con plásmido del gen informador y plásmido de expresión del factor de transcripción***.
(7) Extraer la proteína y utilizarla para la detección de luciferasa.
(8) Añadir sustrato y medir la actividad luciferasa.
(9) Calcular la intensidad de fluorescencia relativa y compararla con el control vacío.