El espectrofotómetro es un tipo muy importante de instrumento analítico, ya sea en los campos de la física, la química, la biología, la medicina, la ciencia de los materiales, las ciencias ambientales y otros campos de investigación científica, o en la industria química, la medicina y las pruebas ambientales. En los departamentos modernos de producción y gestión, como la metalurgia, los espectrofotómetros UV-visible tienen aplicaciones amplias e importantes. Un espectrofotómetro es un instrumento que utiliza espectrofotometría para realizar análisis cuantitativos y cualitativos de sustancias. A menudo se utiliza para la cuantificación de ácidos nucleicos, proteínas y concentración de crecimiento bacteriano.
El espectrofotómetro de ultratrazas se ha convertido en un instrumento de rutina en los laboratorios de biología molecular modernos. Comúnmente utilizado para la cuantificación de ácidos nucleicos, proteínas y concentración de crecimiento bacteriano. La cuantificación de ácidos nucleicos es la función más utilizada de los espectrofotómetros de ultramicrovolúmenes. Puede cuantificar oligonucleótidos, ADN monocatenario y bicatenario y ARN disueltos en tampón. La longitud de onda de absorción del pico de absorción más alto del ácido nucleico es de 260 nm. Cada tipo de ácido nucleico tiene una composición molecular diferente, por lo que sus factores de conversión son diferentes. Para cuantificar diferentes tipos de ácidos nucleicos es necesario seleccionar previamente los coeficientes correspondientes. Por ejemplo: el valor de absorbancia de 1OD es equivalente a 50 μg/ml de ADNds, 37 μg/ml de ADNss, 40 μg/ml de ARN y 30 μg/ml de Olig. El valor de absorbancia después de la prueba se convierte mediante el coeficiente anterior para obtener la concentración de muestra correspondiente. Antes de realizar la prueba, seleccione el programa correcto, ingrese los volúmenes de la solución original y el diluyente, y luego pruebe la solución en blanco y la solución de muestra. Sin embargo, el experimento no fue todo fácil. Las lecturas inestables pueden ser el mayor dolor de cabeza para los experimentadores. Los instrumentos con mayor sensibilidad exhibirán una mayor deriva de absorbancia.
De hecho, el principio de diseño y el principio de funcionamiento del espectrofotómetro permiten que el valor de absorbancia cambie dentro de un cierto rango, es decir, el instrumento tiene cierta exactitud y precisión. Por ejemplo, la precisión del espectrofotómetro de ultratrazas Böhne Colibri de Alemania es ≤1,0% (1A). Es normal que los resultados de múltiples pruebas varíen entre aproximadamente el 1,0% del valor promedio. Además, también es necesario considerar las propiedades físicas y químicas del propio ácido nucleico y el valor de pH y la concentración de iones del tampón en el que se disuelve el ácido nucleico: durante la prueba, si la concentración de iones es demasiado alta, También causan deriva en la lectura, por lo que se recomienda usar un tampón con un cierto valor de pH y una baja concentración de iones. Los tampones, como TE, pueden estabilizar en gran medida las lecturas. La concentración de dilución de la muestra también es un factor que no se puede ignorar: inevitablemente hay algunas partículas finas en la muestra, especialmente muestras de ácido nucleico. La presencia de estas pequeñas partículas interfiere con los resultados de la prueba. Para minimizar el impacto de las partículas en los resultados de la prueba, se requiere que el valor de absorbancia del ácido nucleico sea al menos superior a 0,1 A, y el valor de absorbancia es preferiblemente de 0,1 a 1,5 A. Dentro de este rango, la interferencia de partículas es relativamente pequeña y los resultados son estables. Esto significa que la concentración de la muestra no puede ser ni demasiado baja ni demasiado alta (superando el rango de prueba del fotómetro). Finalmente, existen factores operativos, como una mezcla suficiente; de lo contrario, el valor de absorbancia será demasiado bajo, o incluso negativo, no debe haber burbujas en la solución mezclada ni sólidos suspendidos en la solución en blanco; de lo contrario, las lecturas variarán drásticamente; ; se debe usar la misma cubeta para probar la solución en blanco y la muestra; de lo contrario, la diferencia de concentración es demasiado grande; el coeficiente de conversión es consistente con la selección de la unidad de concentración de la muestra; no se pueden usar cubetas con ventanas desgastadas; alcanzar el volumen mínimo requerido por la cubeta y muchas otras cuestiones operativas.
Además de la concentración de ácido nucleico, el espectrofotómetro también muestra varias proporciones muy importantes que indican la pureza de la muestra, como la proporción de A260/A280, que se utiliza para evaluar la pureza de la muestra porque la El pico de absorción de proteínas es de 280 nm. Para muestras puras, la proporción es superior a 1,8 (ADN) o 2,0 (ARN). Si la proporción es inferior a 1,8 o 2,0, indica influencia de proteínas o sustancias fenólicas. A230 indica que hay algunos contaminantes en la muestra, como carbohidratos, péptidos, fenol, etc., y la proporción de ácidos nucleicos relativamente puros A260/A230 es superior a 2,0. A320 detecta la turbidez y otros factores de interferencia de la solución. Para muestras puras, A320 es generalmente 0. La proteína suele ser un compuesto de múltiples proteínas. El método colorimétrico se basa en los componentes proteicos: los aminoácidos (como la tirosina, la serina) reaccionan con grupos cromogénicos externos o colorantes para producir sustancias coloreadas. La concentración de sustancias coloreadas está directamente relacionada con la cantidad de aminoácidos reaccionados por la proteína, reflejando así la concentración de proteína.
Los métodos colorimétricos generalmente incluyen BCA, Bradford, Lowry y otros métodos.
Método Lowry: basado en la reacción de Biuret más temprana y mejorada. La proteína reacciona con Cu2 para producir un reactivo azul.
Sin embargo, el método Lowry es más sensible que el Biuret. Las desventajas son que es necesario agregar varios reactivos de reacción secuencialmente; la reacción lleva mucho tiempo; las sustancias no proteicas que contienen EDTA, Triton x-100, sulfato de amoníaco y otras sustancias no son adecuadas; método.
Método BCA (ensayo del ácido de bicinconinina): Este es un método de prueba de proteínas más nuevo y más sensible. La proteína a analizar reacciona con Cu2 en una solución alcalina para producir Cu, que forma un quelato con BCA para formar un compuesto de color púrpura con un pico de absorción a una longitud de onda de 562 nm. Este compuesto tiene una relación lineal muy fuerte con la concentración de proteínas y el compuesto formado después de la reacción es muy estable. Comparado con el método Lowry, es sencillo de operar y muy sensible. Sin embargo, al igual que el método Lowry, es susceptible a interferencias entre proteínas y detergentes.
Método Bradford: El principio de este método es que la reacción de unión de la proteína y el azul brillante de Coomassie produce un compuesto coloreado con un pico de absorción de 595 nm. Su característica más importante es que tiene buena sensibilidad, que es el doble que los métodos de prueba de Lowry y BCA; es más sencillo de operar y más rápido; solo requiere un reactivo de reacción; el compuesto puede ser estable durante 1 hora, lo que es conveniente para los resultados; es compatible con una serie de agentes reductores (como DTT, mercaptoetanol) que interfieren con la reacción de Lowry, BCA. Pero sigue siendo sensible a los detergentes. La principal desventaja es que diferentes estándares darán lugar a grandes diferencias en los resultados de la misma muestra, haciéndolos incomparables.
Algunos investigadores que son nuevos en la medición colorimétrica pueden sentirse confundidos por los resultados inconsistentes obtenidos por varios métodos colorimétricos. ¿En qué método deberían confiar? Dado que los grupos de reacción y los grupos cromogénicos de varios métodos son diferentes, las concentraciones de muestra obtenidas utilizando varios métodos al mismo tiempo para la misma muestra no son comparables. Por ejemplo: Keller et al. probaron la proteína en la leche humana y encontraron que las concentraciones medidas por Lowry y BCA eran significativamente más altas que las medidas por Bradford, y la diferencia era significativa. Incluso si se mide la misma muestra, la muestra estándar seleccionada mediante el mismo método colorimétrico es inconsistente y la concentración después de la prueba también es inconsistente. Por ejemplo, se utiliza Lowry para analizar la proteína en homogeneizado celular como estándar con una concentración de 1,34 mg/ml y como estándar con una concentración de 2,64 mg/ml. Por lo tanto, antes de elegir un método colorimétrico, es mejor consultar la composición química de la muestra a analizar y buscar una proteína estándar con una composición química similar a la del estándar. Además, al cuantificar proteínas mediante métodos colorimétricos, un problema común es que el valor de absorbancia de la muestra es demasiado bajo, lo que genera una gran diferencia entre la concentración medida de la muestra y la concentración real. La cuestión clave es que el color de la cubeta, un accesorio importante del espectrofotómetro 1011 después de la reacción, tiene una vida media determinada, por lo que cada método colorimétrico enumera el tiempo de prueba de reacción y todas las muestras (incluidas las muestras estándar) deben someterse a pruebas. realizarse dentro de este tiempo. Si el tiempo es demasiado largo, el valor de absorbancia obtenido se vuelve más pequeño y el valor de concentración convertido disminuye. Además, la temperatura de reacción, el pH de la solución, etc. son factores importantes que afectan el experimento. Además, muy importante, lo mejor es utilizar el método colorimétrico en plásticos. Evite el uso de cubetas hechas de cuarzo o vidrio, ya que el color después de la reacción manchará el cuarzo o el vidrio, lo que dará como resultado valores de absorbancia de muestra inexactos. El laboratorio determina la densidad de crecimiento bacteriano y el período de crecimiento, y principalmente infiere la densidad de crecimiento bacteriano basándose en la experiencia y la inspección visual. En experimentos más exigentes, es necesario utilizar un espectrofotómetro para medir con precisión la densidad de las células bacterianas. OD600 es el método estándar para rastrear el crecimiento microbiano en cultivos líquidos. El medio de cultivo sin líquido bacteriano añadido se usó como líquido blanco y luego se cuantificó el medio de cultivo que contenía bacterias después del cultivo. Para asegurar un correcto funcionamiento se debe desarrollar una curva de calibración para cada microorganismo y cada instrumento mediante el conteo de células mediante un microscopio. Ocasionalmente en el experimento, el valor de OD de la solución bacteriana aparecerá negativo. La razón es que se utiliza un medio de cultivo cromogénico, es decir, después de que las bacterias se cultivan durante un período de tiempo, reaccionan con el medio de cultivo y un color. se produce el cambio. Además, cabe señalar que las muestras analizadas no se pueden centrifugar para mantener las bacterias en suspensión.