En medio Luria-Bertagne (LB) suplementado con 100 mg L-1 de ampicilina, incubar en un matraz agitado durante 4 horas a 37 °C y 200 rpm, luego incubar a 100 rpm durante 10 horas. Las células se recogieron de un total de 3 litros de cultivo, se resuspendieron en tampón fosfato potásico 100 mM (pH 7,0, que contiene fluoruro de 1?m-fenilsulfonilo (PMSF) hasta OD600) 600 y se incubaron en un medio de prensa francesa (SLM-Aminco). Lisis
Traducción: Los cultivos de E. coli que expresan globina se cultivaron en matraces agitados de 100 a 200 °C durante 4 h en luria-Bolta suplementado con 100 mg L-1 de ampicilina (libra). Se recogieron células de 3 cultivos y se suspendieron en tampón fosfato potásico 100 mM a pH 7,0 y 1,5. El fluoruro de metafenilsulfonilo (PMSF) alcanzó una DO600)600 y fue descifrado en un periódico francés (SLM Aminco).
Traducción 2:
Todos los pasos de purificación de proteínas se realizaron a 4°C. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación y se filtraron (0,45 µm). Las proteínas Hb y flavoHb marcadas con His se purificaron en una columna de afinidad, columna quelante Sephadex HisTrap (Amersham Pharmacia Biotech) y en tampón de imidazol (imidazol 40 y 300 mM en tampón de fosfato de potasio 100 mM, pH 7,0). Eluir paso a paso y luego con una columna de desalación. (Sefadex G25). Se estima que la pureza de la muestra es del 95% de Hbs bacterianas gt y del 90% de flavohemoglobina en gel de poliacrilamida gtSDS-12 teñido con azul brillante de Coomassie.
Se han completado todos los pasos de purificación de la proteína, aclara. por lisis por centrifugación a 4 °C.
Y filtro (0,45?m). La hemoglobina marcada con His y la flavoHb se purificaron a través de una columna de afinidad de proteínas, una columna quelante HisTrap de dextrano (solución de separación), un tampón de fosfato de potasio de 100 mm, un tampón de imidazol de pH 7,0 (elución gradual de imidazol de 40 y 300 mm) y desalinización (el dextrano llega a la carretera este). Se estimó que la pureza de la muestra era "95 hemoglobina bacteriana"
De las cuales 90 se tiñeron con SDS flavoHbs-12 gel de poliacrilamida Coomassie Brilliant Blue.
Traducción 3:
Se liberó FAD de la flavoHb hirviendo muestras de proteína purificada durante 3 minutos y se midió a 520 nm con excitación a 460 nm en comparación con FAD puro como fluorescencia estándar para determinar el contenido de DCP.
Determinación del contenido de la base La base consiste en flavoHb (muestra de proteína purificada hervida durante 3 minutos) y fluorescencia de excitación de 520 nm, que se determina que libera 460 nm, en comparación con una base relativamente pura utilizada como estándar.