El proceso de operación de la columna incluye: selección del método de operación de cromatografía en columna, selección de las especificaciones de la columna y empaquetamiento de la columna.
1. Selección de métodos operativos de cromatografía en columna:
En la actualidad, los métodos operativos de cromatografía en columna incluyen principalmente tres modos: separación a presión normal, separación a presión reducida y separación a presión.
Columna de presión: adecuada para purificación de productos inferiores a 100-200g. Las columnas plus de gran tamaño son difíciles de fabricar y peligrosas de utilizar. Se recomienda utilizar doble cadena de bolas para la presurización.
Columna de descompresión: apta para cualquier cantidad de paso de columna, más rápida que la columna presurizada. Es necesario reducir la polaridad de la fase móvil para pasar a través de la columna (el doble que la de la columna presurizada). de lo contrario, el efecto de separación será deficiente.
Columna de presión normal: apta para productos superiores a 50-100g. La columna de presión normal tiene el mejor efecto de separación, pero también es la que lleva más tiempo. La separación por presión normal es el modo de separación más simple, que es conveniente y simple, pero lleva mucho tiempo eluir.
Aunque la separación al vacío puede ahorrar el uso del empaque, debido a la gran cantidad de aire que pasa a través del empaque, el solvente se volatilizará y, a veces, el vapor de agua se condensará fuera de la columna y algunos compuestos que se descomponen fácilmente se difícil de obtener Y también debes usar una bomba de agua o una bomba de vacío para extraer aire.
2. Selección de especificaciones de columnas:
Existen en el mercado varias especificaciones de columnas de separación por cromatografía en columna. Cuanto más larga sea la columna, mayor será el número de platos correspondiente y mejor será la separación. La relación diámetro-altura de las columnas actualmente en el mercado generalmente está en el rango de 1:5 a 10. En el uso real, la cantidad de relleno es generalmente de 30 a 70 veces la cantidad de muestra. La selección específica depende del análisis específico. de la naturaleza y contenido de la muestra.
Si la separación entre los componentes requeridos y las impurezas es grande, puede reducir la cantidad de relleno y utilizar una columna con un diámetro interior relativamente pequeño (como una columna de 2 cm × 20 cm si la diferencia Rf); es inferior a 0,1, entonces Para agrandar la columna y aumentar la cantidad de relleno, por ejemplo, utilice una columna con un diámetro interior de 3 cm.
3. Empaquetado de columnas:
Existen dos métodos principales para empaquetar columnas de cromatografía en columna: método húmedo y método seco. El método húmedo ahorra problemas. gel de sílice (La superficie superior de la fase estacionaria debe ser plana. El empaquetamiento húmedo de la columna consiste en mezclar primero el gel de sílice con un solvente apropiado, luego llenarlo en la columna y luego presurizarlo y usar el eluyente para "recorrer la columna". La mayor ventaja de este método es que la columna generalmente está empaquetada de manera relativamente firme. sin burbujas. ?
El empaque de columna seca implica llenar el gel de sílice directamente en la columna, luego golpear suavemente ambos lados de la columna hasta que la interfaz del gel de sílice ya no caiga, luego llenar el gel de sílice a la altura adecuada y finalmente usar una bomba de aceite para bombear directamente, de modo que la columna se instale muy firmemente.