Medición de la actividad catalasa: método de absorción UV
Principio
El H2O2 tiene una fuerte absorción en la longitud de onda de 240 nm y la catalasa puede descomponerlo debido a la oxidación del hidrógeno. La absorbancia (A240) de la solución de reacción disminuirá con el tiempo de reacción. La actividad catalasa se puede medir midiendo la tasa de cambio en la absorbancia.
Instrumentos y Utensilios
Espectrofotómetro UV; centrífuga; 1 matraz aforado de 250ml; 2 pajitas graduadas de 0,5ml, 1 pajita graduada de 2ml; 3 tubos de ensayo de 10ml; ;
Reactivo
0,2mol/L de tampón fosfato pH7,8 (que contiene 1% de polivinilpirrolidona);
0,1mol/L H2O2 (calibrado con 0,1mol/ L permanganato de potasio).
Método
1. Extracción líquida enzimática: Pesar 0,5 g de hojas frescas de trigo u otros tejidos vegetales en un mortero y añadir de 2 a 3 ml de pH 7,0 preenfriado a 4ºC. °C Después de moler la solución tampón de fosfato y una pequeña cantidad de arena de cuarzo hasta obtener un homogeneizado, transfiéralo a un matraz volumétrico de 25 ml, enjuague el mortero varias veces con la solución tampón, combine las soluciones de enjuague y ajuste el volumen hasta la marca. . Mezclar uniformemente y colocar el matraz medidor en un refrigerador a 5°C durante 10 minutos. Tomar el líquido clarificado superior y centrifugarlo a 4000 rpm durante 15 minutos. El líquido sobrenadante es el extracto crudo de catalasa. Conservar a 5°C para su uso posterior.
2. Medición: Tome 3 tubos de ensayo de 10 ml, 2 de los cuales son tubos de medición de muestra y 1 es un tubo en blanco. Agregue los reactivos en el orden que se muestra en la Tabla 40-2.
Tabla 40-2 Tabla de configuración del líquido de muestra para la determinación de H2O2 mediante el método de absorción UV
Número de tubo
S1
S2
S3
Solución enzimática bruta (ml)
0,2
0,2
0,2
pH7,8 Ácido fosfórico (ml)
1,5
1,5
1,5
Agua destilada (ml)
1,0
1,0
1,0
Después de precalentar a 25°C, añadir 0,3ml 0,1mol/L H2O2 tubo a tubo. Marcar el tiempo inmediatamente después de cada uno. Se agrega el tubo y se vierte rápidamente en una taza colorimétrica de cuarzo, se mide la absorbancia a 240 nm, se lee cada 1 minuto y se mide durante 4 minutos. Una vez medidos los tres tubos, se calcula la actividad enzimática de acuerdo con lo siguiente. fórmula.
3. Cálculo del resultado:
La cantidad de enzima que reduce el A240 en 0,1 en 1 minuto es 1 unidad de actividad enzimática (u).
Actividad catalasa (u/gFW/min) =
Donde A240 = AS0-
AS0: tubo de control con solución de enzima hervida agregada Valor de absorbancia
; p>
AS1, AS2: valor de absorbancia del tubo de muestra;
Vt: volumen total de extracto enzimático bruto (ml);
V1: extracto enzimático bruto para determinación Líquido enzimático; volumen (ml);
FW: peso fresco de la muestra (g);
0,1: cada disminución de 0,1 en A240 es 1 unidad de actividad enzimática (u);
t: el tiempo desde la adición de peróxido de hidrógeno hasta la última lectura (min).