① Los cebadores deben diseñarse dentro de la región conservada de la serie de ácidos nucleicos y ser específicos.
La homología entre el cebador y la secuencia de amplificación no específica no debe exceder el 70% ni tener 8 bases complementarias consecutivas de homología.
② El producto no puede formar una estructura secundaria.
La razón principal por la que algunos cebadores son ineficaces es la influencia de la estructura secundaria del ADN en la región repetida del cebador. Es mejor evitar la región de la estructura secundaria al seleccionar fragmentos amplificados.
③ La longitud del primer generalmente es de entre 15 y 30 bases.
④ El contenido de G+C está entre el 40% y el 60%.
⑤ Las bases deben estar distribuidas aleatoriamente.
La distribución de las cuatro bases en el cebador debe ser aleatoria y no debe contener polipurina ni polipirimidina. En particular, el extremo 3' no debe exceder 3 G o C consecutivos, porque esto provocará que el cebador cebe mal en la región de secuencia rica en G+C.
⑥El cebador en sí
El cebador en sí no debe tener una secuencia complementaria; de lo contrario, el cebador en sí se plegará formando una estructura en forma de horquilla y el cebador en sí se renaturalizará. Esta estructura secundaria afectará la combinación de renaturalización de cebador y plantilla debido al impedimento estérico. Si se utiliza el juicio manual, las bases complementarias consecutivas del propio cebador no pueden tener más de 3 pb.
⑦Entre cebadores
No debe faltar la complementariedad entre los dos cebadores, especialmente el solapamiento complementario en el extremo 3' para evitar la formación de dímeros de cebador. No debe haber más de 4 bases consecutivas de homología o complementariedad entre un par de cebadores.
⑧ El extremo 5′ del cebador se puede modificar.
El extremo 5' del cebador limita la longitud del producto de la PCR y tiene poco efecto sobre la especificidad de la amplificación. Por tanto, puede modificarse sin afectar la especificidad de la amplificación. Las modificaciones en el extremo 5' del cebador incluyen: agregar sitios de corte de enzimas; marcar con biotina, fluorescencia, digoxigenina, Eu3+, etc.; introducir secuencias de ADN de unión a proteínas, secuencias de mutación de inserción y deleción, e introducir un promotor; secuencia, etc
⑨ El extremo 3′ del cebador no se puede modificar.
La extensión del cebador comienza desde el extremo 3′ y no se puede modificar de ninguna manera. El extremo 3' no puede formar ninguna estructura secundaria. Excepto en reacciones especiales de PCR (AS-PCR), el extremo 3' del cebador no puede coincidir incorrectamente.
⑩ El extremo 3′ del cebador debe evitar la tercera posición del codón.
Si se amplifica una región codificante, el extremo 3' del cebador no debe terminar en la tercera posición del codón, porque la tercera posición del codón es propensa a la degeneración, lo que afectará la especificidad y eficiencia de la amplificación. .