Las benzodiazepinas tienen una alta tasa de unión a proteínas plasmáticas, y la tasa de unión a proteínas plasmáticas del diazepam llega al 99%. Debido a su alta solubilidad en grasas, puede distribuirse rápidamente en los tejidos y acumularse en el tejido adiposo. Las inyecciones intravenosas se distribuyen primero en el cerebro y otros tejidos y órganos ricos en sangre. La concentración en el líquido cefalorraquídeo es aproximadamente igual a la del plasma. Luego se redistribuye y se acumula en el tejido adiposo y muscular con volúmenes de distribución muy grandes, especialmente en pacientes de edad avanzada.
Estos fármacos se biotransforman principalmente bajo la acción de las enzimas hepáticas. La mayoría de los metabolitos de los fármacos tienen una actividad similar a la del fármaco original y tienen una vida media más larga que el fármaco original. Por ejemplo, la semivida plasmática del fludiazepam es de sólo 2 a 3 horas, mientras que la semivida plasmática de su principal metabolito activo, el fludiazepam N-desalquilado, es de más de 50 horas. Cuando se utilizan fármacos de acción prolongada de forma continua, se debe prestar atención a la acumulación del fármaco y sus metabolitos activos en el organismo. Las benzodiazepinas y sus metabolitos eventualmente se vuelven inactivos por conjugación con ácido glucurónico y se excretan a través de los riñones. El grupo hidroxilo en la estructura se puede combinar directamente con ácido glucurónico y desactivar, y se ve menos afectado por otros factores. Durante el proceso de biotransformación, el grupo nitro en la estructura de 7 posiciones (como el nitrazepam) se reduce a un grupo amino y luego se acetila a acetamido. Ambos metabolitos son biológicamente inactivos y esta vía metabólica se ve menos afectada por otros factores. Sin embargo, el metabolismo oxidativo de estos fármacos en el organismo se ve fácilmente afectado por la función hepática, la edad y el consumo de alcohol al mismo tiempo, lo que prolonga la t1/2.