Chino
Con el desarrollo de la ingeniería genética de resistencia a enfermedades de las plantas, se han descubierto cada vez más genes de resistencia a enfermedades. En 2004, Taler et al. clonaron dos genes de resistencia al mildiú velloso del melón, At1 y At2, con actividad de serina glioxilato aminotransferasa (SGT) de variedades de melón silvestre de la India. Taler et al. descubrieron que At1 y At2 tienen actividad de serina glioxilato aminotransferasa relacionada con la vía de fotorrespiración de la planta y no pertenecen a ningún gen R conocido. Su resistencia a las bacterias patógenas no es específica de la especie y su resistencia a las enfermedades está relacionada con el H_2O_2. Basándose en este fenómeno, propusieron un nuevo mecanismo de resistencia a las enfermedades, "resistencia enzimática a las enfermedades", que es el primer informe que confiere resistencia a las enfermedades a las plantas cambiando la expresión de las enzimas. Se especula que At1 y At2 también pueden ser resistentes a una variedad de otras enfermedades de las hojas de las plantas además del mildiú, y son genes de resistencia a enfermedades de gran valor para la investigación. Además, el mecanismo de “resistencia a las enfermedades enzimáticas” requiere más evidencia genética y apoyo experimental. En base a esto, se clonó el gen homólogo GmSGT de At1 y At2 a partir de soja con fuerte fotorrespiración, y se le realizaron análisis de secuencia, predicción del centro de actividad enzimática y análisis de expresión procariótica, y se transfirió a plantas receptoras para la identificación de resistencia a enfermedades. Los principales resultados de la investigación y los puntos de innovación de este artículo se resumen a continuación: 1. Utilizando secuencias EST de soja y tecnología 5'-Race, se clonó por primera vez la secuencia del gen GmGGT1 que codifica la serina glioxilato aminotransferasa a partir de variedades resistentes al mildiú de la soja (se ha obtenido una patente de invención nacional, número de patente: ZL2005100887 83.4). Al mismo tiempo, se clonaron dos genes homólogos de GmSGT1, GMS GT 2 y GMS GT 3, a partir de la variedad Heinong 10 susceptible inducida por SA. El análisis de secuencia mostró que GmSGT1 tiene una homología de secuencia de aminoácidos de 88,03 y 87,78 con los genes de resistencia al mildiú del melón At1 y At2 informados por Taler et al. La glioxilato aminotransferasa tiene una homología de 83,33-85,79. El análisis de secuencia de la proteína deducida de GmSGT1 mostró que posee un sitio de unión de piridoxal-5-fosfato GSQKAL y una fuerte señal de localización de peroxisoma SRI, lo que sugiere que este gen puede funcionar en las peroxidasas de las plantas a través de la fotorrespiración y desempeñar un papel en el cuerpo. La homología de secuencia de nucleótidos de GmSGT2 y GmSGT3 con GmSGT1 es tan alta como 96,38 y 99,17, y la homología de secuencia de aminoácidos deducida es 97,03 y 99,25. Los centros activos enzimáticos de GMS GT 1, GMS GT 2 y GMS GT 3 se analizaron mediante métodos bioinformáticos. Los resultados mostraron que las tres secuencias de proteínas tenían actividad de serina glioxilato aminotransferasa. 2. Al simular la vía de fotorrespiración de las plantas en E. coli, se descubrió por primera vez que GmSGT1 tiene actividad serina glioxilato aminotransferasa. Reacciones en la vía fotorrespiratoria: ácido glicólico (? H2O 2 ácido glioxílico; ácido glioxílico (?) ácido glioxílico. Debido a que E. coli contiene glicolato oxidasa (GOX), se puede agregar ácido glicólico a la cepa de expresión procariótica para completar la reacción anterior. Al detectar cambios en el contenido de H2O2, se puede determinar la función de serina glioxilato aminotransferasa del gen GmSGT1. Los resultados de la investigación muestran que solo el componente que expresa la proteína GmSGT1 puede inducir la producción de una gran cantidad de H2O2, mientras que el grupo de control no. se puede confirmar que GmSGT1 tiene actividad serina glioxilato aminotransferasa 3. El análisis de la correlación entre la proteína GmSGT y la resistencia de diferentes variedades de soja mostró que en las variedades resistentes al mildiú Zaofeng 5 y Jiunong 9, la expresión de la proteína objetivo podría ser. detectado, pero la expresión de la proteína diana no se detectó en la variedad susceptible Heinong 10. Los resultados de RT-PCR semicuantitativa antes y después de la inducción de SA mostraron que la expresión de la variedad susceptible Heinong 10 no se detectó antes de la inducción de SA. pero ligeramente expresado después de la inducción de SA, la resistencia de la soja al daño por congelación mejora enormemente. Por lo tanto, inferimos que la expresión de GmSGH está relacionada con la vía de inducción de SA y, a medida que aumenta la expresión de GmSGT1, la resistencia de la soja a la vellosa. moho. También mejoró significativamente.
4. Se construyó el vector de expresión vegetal GmSGT1, se obtuvieron plantas transgénicas mediante transformación del tabaco y se identificó su resistencia a la mancha marrón, el mango negro y la marchitez bacteriana. Los resultados mostraron que el tabaco transgénico mejoró significativamente la resistencia del tabaco a la mancha marrón, el mango negro y la marchitez bacteriana. Este estudio proporciona nueva evidencia experimental para los “genes de resistencia a enzimas” de las plantas propuestos por Taler et al.5. Utilizando como material la variedad resistente a enfermedades Zaofeng 5, se estudiaron las características de expresión espacial y temporal del gen de soja transgénica GmSGT1 en soja. Este gen se expresa en las hojas de la soja, pero no en las raíces y los tallos. El nivel de expresión aumenta con el período de crecimiento y es más fuerte durante el período de crecimiento reproductivo, y luego se debilita y desaparece a medida que las células envejecen. Esto muestra que la tendencia cambiante de GmSGT1 es consistente con la tendencia cambiante de la fotorrespiración de las plantas. También se detectaron las características de expresión de la glicolato oxidasa (GOX), que actúa aguas arriba de la serina glioxilato aminotransferasa en la vía de la fotorrespiración. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de GOX era consistente con el de GmSGT1, lo que indica que la respuesta ascendente de la expresión de GmSGT1 y H2O2 mejoró simultáneamente. Esto es consistente con nuestra conclusión de que la proteína GmSGT desempeña un papel en la vía de fotorrespiración de las plantas. 6. Se determinó el sistema de transformación genética de la soja. Se estableció el sistema de cultivo de tejidos de soja Zaofeng 5 y Heinong 10, y el vector de expresión vegetal construido pIM1.1-GmSGT-plus se transformó en Zaofeng 5 y el vector de expresión vegetal RNAi pIM1.1- mediante el método mediado por Agrobacterium. . Al mismo tiempo, se estudiaron los efectos de la frecuencia de regeneración, el tiempo de regeneración, la concentración de detección de K y los diferentes tiempos de infección por Agrobacterium sobre la frecuencia de regeneración de las yemas regeneradas, lo que proporcionó una base experimental para optimizar aún más el cultivo de tejidos y el sistema de transformación de Zaofeng 5.
Español
Con el desarrollo de genes de resistencia a enfermedades de las plantas, se han descubierto cada vez más genes de resistencia a enfermedades en el cuerpo humano. En 2004, Taler y otras variedades de melón silvestre de la India resistentes al mildiú habían clonado dos genes de resistencia al mildiú del melón, At1 y At2, con actividad de serinaglioxilato aminotransferasa (SGT). Taler At1 y At2 son genes que tienen actividad de serina glioxilato aminotransferasa y vía de fotorrespiración de las plantas. No pertenecen a ninguna clase conocida de genes R y no tienen resistencia especial a los patógenos. Su resistencia a las enfermedades es similar a la de los relacionados con el H2O 2. Basándose en este fenómeno, propusieron un nuevo mecanismo de resistencia a las enfermedades, la "resistencia enzimática", que es el primer informe que confiere resistencia a las enfermedades a las plantas cambiando la expresión de las enzimas. Se especula que At1 y At2 pueden tener una resistencia más fuerte también al mildiú velloso que muchas otras enfermedades de las hojas de las plantas, lo que indica que este gen de resistencia tiene un gran valor de investigación, y la propuesta del mecanismo de la "enzima de resistencia" requiere más genes para respaldar y probar. . En consecuencia, este artículo clonó el gen homólogo GmSGT de los clones fotorrespiratorios de soja At1 y At2, realizó análisis de secuencia, predicción del sitio activo de la enzima, análisis de expresión procariótica y lo transfirió a plantas receptoras para la identificación de la resistencia a enfermedades. Los principales hallazgos e innovaciones del artículo se resumen a continuación: 1. Utilizando la secuencia EST de soja y utilizando la tecnología 5'-Race, el gen que codifica la secuencia de serina glioxilato aminotransferasa gmg gt 1 se clonó por primera vez a partir de una variedad de soja resistente al mildiú (obtuvo una patente de invención nacional, número de patente: ZL2005100887 83.4). , de dos Entre las variedades de soja susceptibles al mildiú velloso inducido por SA, 10 agricultores negros han clonado dos genes homólogos de GmSGT1, GmSGT2 y GmSGT3. El análisis de secuencia mostró que la homología de secuencia de aminoácidos de GmSGT1 y otros genes de resistencia al mildiú velloso del melón de At1 y At2 era tan alta como 88,03 y 87,78; al mismo tiempo, GmSGT1 se compartía con Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) y arroz (Oryzae); sativa L.), Fritillaria (Fritillaria), lenteja de agua (Spirodela polyrrhiza) La homología de serina glioxilato aminotransferasa es 83,33-85,79.
El análisis de la secuencia de proteínas deducida de GMS gt 1 mostró que tiene un sitio de unión de piridoxal-5-fosfato GSQKAL y una fuerte señal de direccionamiento de peroxisoma SRI, lo que indica que este gen puede estar involucrado en la fotosíntesis peroxisomal de las plantas. GmSGT2 Las homologías de secuencia de nucleótidos de GmSGT3 y GmSGT1 son tan alto como 96,38 y 99,17, y las homologías de secuencia de aminoácidos deducidas son 97,03 y 99,25. Los sitios activos enzimáticos de las proteínas GmSGT1, GmSGT2 y GmSGT3 se analizaron mediante métodos bioinformáticos. Los resultados mostraron que todas estas tres secuencias de proteínas tienen actividad de serina glioxilato aminotransferasa. Se producen reacciones en la vía de fotorrespiración: ácido glicólico (?) H2O 2 ácido glioxílico (?) ácido glioxílico; Debido a que E. coli contiene glicolato oxidasa (GOX), la cepa original se expresó agregando ácido para completar la reacción anterior. La función del gen de la serina glioxilato aminotransferasa GmSGT1 se puede determinar detectando cambios en la cantidad de H2O2. Los resultados muestran que sólo la expresión del componente proteico GmSGT1 puede inducir la producción a gran escala de H_2O_2, pero el componente de control no. Por lo tanto, se puede utilizar serina para determinar la actividad de la glioxilato aminotransferasa de GmSGT1. Los resultados de la transferencia Western mostraron que se podía detectar expresión dirigida en las variedades resistentes al mildiú Zao 5 y Zao 9 Nong 9, mientras que Heinong 10 era susceptible y no tenía expresión. Los resultados semicuantitativos de RT-PCR antes y después de la inducción de SA mostraron que la expresión de Heinong No. 10 susceptible no se detectó antes de la inducción de SA, mientras que la resistencia de las trazas de soja inducidas por SA a la enzima de la crema mejoró enormemente. Por lo tanto, inferimos que el patrón de expresión inducida de GmSGT1 es real y relevante, y a medida que aumenta la expresión de GmSGT1, la resistencia de la soja al mildiú también mejora significativamente. 4. Se construyó el vector de expresión de plantas GMS gt 1 para la transformación del tabaco, se obtuvieron plantas transgénicas y se obtuvo la identificación de la resistencia del tabaco a la mancha marrón, el mango negro y la marchitez bacteriana. Los resultados mostraron que el tabaco transgénico mejoró significativamente la tasa de crecimiento de. Tabaco Resistencia a la mancha marrón, mango negro y marchitez bacteriana. Thaler et al. Este estudio propone "genes de resistencia a enzimas" vegetales y proporciona nueva evidencia experimental. 5. Se utilizaron las cinco primeras variedades resistentes a enfermedades para explorar las características espaciotemporales de la abundante expresión del gen GmSGT1 en la soja. El gen se expresa en las hojas de la soja, pero no en las raíces y los tallos, y el nivel de expresión aumenta con el paso del crecimiento. aumenta, expresándose mayormente en la etapa reproductiva, y luego disminuye con el envejecimiento celular hasta desaparecer. Esto indica una línea de tendencia para la fotorrespiración de GmSGT1 en la planta. Al mismo tiempo, se detectaron las características de expresión de la glicolato oxidasa (GOX) bajo la acción de la serina glioxilato aminotransferasa aguas arriba en la vía de fotorrespiración. Los resultados mostraron que los niveles de expresión de GOX GmSGT1 cambiaron constantemente, lo que indica que mientras que la expresión de GmSGT1 era mayor. mejorada, la reacción aguas arriba también mejoró, la expresión de H_2O_2 también aumentó. Especulamos que GmSGT, una proteína de la vía de fotorrespiración de las plantas, desempeña un papel en la conclusión. 6. Investigación e identificación de sistemas de transformación genética. HSBC estableció un sistema de cultivo de tejido de punta de embrión ya en el día 10 de 5. Soja y Heilongjiang. Utilizó el vector de expresión vegetal mediado por Agrobacterium tumefaciens LBA4404 para transformar el excelente miembro pIM1.1-GmSGT-plus en el 5. RNAi temprano. vector de expresión vegetal El 1er día de la transformación pIM1.1-GmSGT-plusF de Heinong, se obtuvo la regeneración. Al mismo tiempo, se estudiaron la frecuencia de regeneración, el tiempo de regeneración, la concentración de detección de K y el tiempo de infección por Agrobacterium de los tres explantes de Huifeng No. 5, incluida la punta del embrión, el nódulo cotiledón y el hipocótilo, en la regeneración de yemas con diferente regeneración. frecuencias. Una mayor optimización de los sistemas de transformación y cultivo de tejidos proporciona una base experimental.