Cómo elegir el mejor plan de cultivo
Cuando el contenido teórico del cultivo de tejidos vegetales se aplica a plantas específicas y las condiciones experimentales que enfrentan todos, surgen algunos problemas. Aparecerán problemas como cómo coordinar varios vínculos, cómo elegir algunas condiciones óptimas, cómo juzgar si la situación en el trabajo es normal, cómo superar los efectos adversos, cómo inducir a la cultura a desarrollarse en la dirección que queremos, etc. A continuación se presentarán algunos métodos para resolver los problemas anteriores, es decir, hacer preguntas, diseñar experimentos y encontrar respuestas mediante el análisis de resultados experimentales. En la mayoría de los casos, muchos métodos experimentales deben utilizarse de manera flexible según su propia experiencia laboral.
Antes de introducir la selección de cada factor, expliquemos brevemente los métodos de prueba más utilizados.
(1) Métodos de prueba comunes en el cultivo de tejidos vegetales
1. Prueba preliminar
Si estás interesado en una determinada planta, o si tienes dudas sobre ella. un factor, o después de leer un artículo y pensar en problemas similares en sus propios experimentos, simplemente puede formular un plan para determinar aproximadamente si este factor tiene un impacto. ○2 En caso afirmativo, ¿cuál es su extensión y cantidad aproximada? Los dos problemas anteriores se pueden juzgar mediante una prueba aproximada y básicamente se puede lograr el propósito esperado. Luego, podemos seguir el camino de los experimentos preliminares, diseñar un plan experimental relativamente completo, obtener datos experimentales precisos y confiables y profundizar nuestra comprensión del problema.
Los requisitos para la prueba inicial son relativamente bajos y no requieren una consideración cuidadosa. Los requisitos son estrictos y, a menudo, generan una idea. Una vez que se cumplan las condiciones para el cultivo de tejidos vegetales, se puede hacer mucho trabajo. Simplemente colóquelo allí y observe la reacción del cultivo, y luego hágalo cuando haya una reacción. Por lo general, cuanto más experimentada sea la persona, más preciso será su juicio. Esto se debe a que los experimentos preparatorios tienen una mayor tasa de aciertos y pueden encontrar avances en la investigación científica lo antes posible, ampliando así los resultados.
La escala del ensayo inicial es pequeña y no es necesario que las condiciones sean exhaustivas. Si la energía lo permite, haga más experimentos preliminares para acelerar el progreso. Los resultados negativos de la prueba preliminar también son información muy útil, que puede indicar que el problema no está en este aspecto, o que el problema no es simple, y también profundizará las ideas de la investigación. En resumen, los experimentos preparatorios consumen menos tiempo y energía y las preguntas son sencillas, lo que puede hacer que la siguiente etapa del trabajo sea más segura. Muchos estudios formales requieren a menudo algunos experimentos preliminares para descubrir los factores que influyen y sus niveles.
2. Experimento de un solo factor
En un experimento de un solo factor, todas las condiciones y factores se mantienen en el nivel general, solo se cambia un factor y el impacto de este factor. en el experimento se descubre el grado. Por ejemplo, en el medio de cultivo MS, otros componentes y dosis permanecen sin cambios, y solo se cambia la dosis de NAA entre 0, 0,1, 0,5 y 1,0 mg/1 para conocer el efecto de la dosis de NAA sobre el enraizamiento de un cultivo. Esta es una prueba de un solo factor. Los experimentos de un solo factor, excepto por una variable a estudiar, deben ser iguales o lo más parecidos posible, y el experimento debe organizarse de manera muy simple. Cambie un factor a la vez, documentando toda la situación en detalle. Normalmente, después de las pruebas preliminares, se puede programar una prueba más completa de un solo factor para determinar la relación cuantitativa entre ese factor y los resultados de la prueba.
Los experimentos de biología se diferencian de los experimentos de física o química en muchos aspectos. La diferencia más importante y significativa es que los experimentos biológicos requieren el establecimiento de un grupo de control y un grupo experimental. El grupo experimental puede tener uno o varios grupos y, a medida que aumenta la complejidad del experimento, el grupo de control puede tener múltiples grupos. Se requiere que los individuos de prueba del grupo de control y del grupo experimental, es decir, bloques de tejido vegetal u otros cultivos, sean lo más completamente consistentes posible en términos de genética, estado fisiológico, condiciones previas al cultivo, etc. (Esto es más fácil de hacer en cultivo de tejidos). Esto se debe a que hay demasiados factores variables en los objetos de investigación biológica y muchas cosas son difíciles de registrar intuitivamente y convertir en números. La fuente de los materiales de prueba es impura e irregular, y si se producen cambios en el futuro, será imposible determinar si se debe a la influencia de factores de prueba o al resultado de diferencias entre materiales. Los grupos de control generalmente no aplican factores de prueba ni mantienen las condiciones de cultivo originales.
En cada proyecto de tratamiento se suele utilizar un número determinado de materiales de prueba, por lo que debe haber un número determinado de repeticiones. Dependiendo de la escala y los requisitos del experimento, la mayoría de los proyectos tendrán de 4 a 10 botellas, cada botella debe tener al menos 3 cultivos o 3 plántulas. La cantidad y calidad de estos materiales debe ser lo más consistente posible. Cuantas más repeticiones, más cuidadoso será el experimento y más fiables serán los resultados. Los resultados de las pruebas obtenidos deben someterse a un procesamiento matemático adecuado para que la precisión y credibilidad de los resultados de las pruebas puedan juzgarse objetivamente.
3. Experimentos multifactoriales y diseños ortogonales
En los últimos años, con la ayuda de la estadística moderna y otros métodos matemáticos, diseñar experimentos complejos para probar varios factores simultáneamente se ha convertido en una posibilidad. . Esto ha demostrado ventajas significativas en el ahorro de tiempo y esfuerzo al mismo tiempo que proporciona el efecto de varias variables en la interacción. Por ejemplo, cuando se utiliza el diseño ortogonal y la tabla L9, se pueden organizar experimentos con cuatro factores y tres niveles. Uno * * * realiza experimentos con nueve combinaciones diferentes. El resultado equivale a realizar experimentos con 27 combinaciones diferentes. Aunque un experimento ortogonal es una combinación de muchos factores, el papel de cada factor puede demostrarse claramente en el análisis de los resultados experimentales. Por lo tanto, el resultado de una prueba sistemática puede analizar claramente el problema y obtener múltiples beneficios en un tiempo limitado. En el estudio de la reproducción rápida de plantas, se puede utilizar para explorar simultáneamente la dosis adecuada de varios componentes en el medio de cultivo, como citoquininas, auxinas, azúcares y otros componentes. Cuando la cultura tiene indicadores prácticos y confiables que son fáciles de observar y calcular, es decir, cuando es fácil realizar un procesamiento cuantitativo, los experimentos multifactoriales pueden desempeñar un papel en la promoción del proceso experimental y obtener el doble de resultado con la mitad del esfuerzo. . Por ejemplo, número de plántulas, altura de las plántulas, número de raíces, longitud de las raíces, tasa de supervivencia del trasplante, etc.
En ausencia de los indicadores contables claros mencionados anteriormente, como el estado de crecimiento, la cantidad de crecimiento, el potencial de diferenciación, etc. del callo, podemos observar intuitivamente según la experiencia y utilizar la evaluación y puntuación. El método para combinar los indicadores de estado y calidad se convierte en números y luego se procesa estadísticamente. Estrictamente hablando, los indicadores anteriores también pueden cuantificarse después de una cuidadosa medición y análisis. Por ejemplo, para el crecimiento de callos, se puede pesar primero la botella vacía (con medio de cultivo) y luego pesarla después de la inoculación. La diferencia entre los dos pesos es el peso inicial del inóculo inicial. Después de cultivar durante un período de tiempo, primero saque el cultivo (debido a que el pesaje estéril es inconveniente, si el cultivo no se guarda, puede pesarlo directamente), transfiéralo a un medio de cultivo fresco en un frasco para pesar y luego péselo. la botella de pesaje. Encuentre el peso final del cultivo. La diferencia en el peso inicial es el crecimiento de la cultura. También se puede configurar un control y pesar el peso seco. Se puede ver que el procedimiento es muy problemático. En lo que respecta al estado y potencial de diferenciación, también se pueden determinar indicadores cuantitativos prácticos preparando cortes y observándolos al microscopio, pero el proceso anterior sólo puede utilizarse para investigaciones teóricas valiosas. En la mayoría de los proyectos de aplicaciones, es demasiado engorroso y no tiene valor práctico. Al juzgar el método de puntuación según la experiencia, el coeficiente de error es demasiado grande. Por lo tanto, en este tipo de experimento sin indicadores numéricos específicos, es mejor utilizar un experimento de un solo factor para ilustrar el problema. De lo contrario, los efectos de diversos factores se entrelazan, lo que a menudo hace que los resultados sean ininterpretables.
4. Aumentar y cancelar gradualmente los métodos de prueba
En la investigación sobre la diferenciación y regeneración de tejidos vegetales, a menudo se agregan varios nutrientes orgánicos antes de lograr una diferenciación y regeneración confiables. Estos componentes se pueden reducir gradualmente. La adición gradual tiene como objetivo hacer que el experimento sea exitoso, la reducción gradual es reducir el alcance para encontrar los factores con mayor impacto, o simplificar el medio de cultivo para las necesidades reales para reducir costos y facilitar la promoción. Este sencillo método de suma, resta, multiplicación y división se utiliza a menudo cuando se busca la mejor proporción hormonal.
(2) Selección de las principales condiciones de cultivo y factores que influyen
1. Selección del medio de cultivo básico
Entre las especies de plantas que se propagan con éxito in vitro, MS es el medio de cultivo más básico. Entonces, en la cultura general, puedes probarlo primero. Si se encuentran efectos adversos o condiciones insatisfactorias, y si es necesario mejorar el medio basal, es mejor reducir primero la concentración del medio MS. En segundo lugar, puede elegir otros medios con componentes significativamente diferentes de los medios MS para comparar pruebas, como medios B5, Blanco, Nitsch, etc. Por lo general, no es necesario elaborar muchos tipos de oligoelementos y sales de hierro. Simplemente siga la fórmula de los oligoelementos MS y se pueden utilizar en otros componentes de medios de cultivo. La concentración de oligoelementos mixtos es generalmente de 1 ml o 5 ml por litro de medio de cultivo. Cuando se logra una diferenciación y proliferación estables, los oligoelementos se pueden reducir o incluso omitir. Las cantidades de oligoelementos utilizadas en las fórmulas también varían mucho. Por ejemplo, la dosis en medio de cultivo ER es sólo 1/10 en fórmula MS. Los ingredientes orgánicos del medio de cultivo son los que más varían y no es necesario ceñirse a los requisitos de una fórmula determinada. Cuando se encuentran materiales que son difíciles de distinguir, la complejidad del medio de cultivo a menudo aumenta y se agregan continuamente nutrientes potencialmente prometedores o sustancias fisiológicamente activas, y luego se sustraen gradualmente una vez que el cultivo es exitoso. Por lo tanto, se puede descubrir que algunos ingredientes son en realidad factores irrelevantes que contribuyen a los resultados de la prueba. Pero parte de ello sirvió como catalizador.
Cuando el experimento no tiene éxito, agregar todo es mejor que no agregar nada, y la dosis de la mayoría de los ingredientes orgánicos no debe ser demasiado alta, como la biotina, que generalmente es de 0,01 a 0,1 mg/1. Algunos compuestos orgánicos son sustancias esenciales para el crecimiento y diferenciación de los tejidos vegetales y son transportadores de electrones en procesos metabólicos. Puede sintetizarse por sí solo en toda la planta, pero en tejidos aislados, debido al fuerte aumento del área de la herida y al aumento del consumo metabólico, la síntesis se reduce o no se puede sintetizar, o el suministro es insuficiente. Entonces, incluso si rara vez se agrega, es diferente si se agrega o no.
Ejemplos de selección de medios básicos: Las plántulas de racimos de rosas se inoculan en medios MS, B5 y White respectivamente. Los ingredientes de estos tres medios son los mismos excepto por la fórmula básica de sal inorgánica. Después de 1 mes de cultivo, se pueden ver algunos cambios. Transfiera una vez en el segundo mes para continuar cultivando, y nuevamente en el tercer mes. De esta forma, al final del tercer mes o principios del cuarto mes, podrás ver los efectos de estos tres sustratos en el crecimiento y visualización de las plántulas de rosas. Entre ellos, el medio MS es el mejor, con un rápido crecimiento de las plántulas y una alta proliferación. B5 es medio y pobre; el blanco medio es el peor, con un crecimiento lento y una tasa de proliferación baja. Los resultados de la prueba muestran que MS es del 100 %, B5 es aproximadamente del 86 % y White es aproximadamente del 73 %. De esta manera, el medio MS puede seleccionarse como condición básica para la propagación in vitro de rosas. En este ejemplo, los tres medios son el grupo de control, o el medio tratado con MS es el grupo de control.
2. Selección de la proporción de fitohormonas
Según los datos acumulados en la literatura sobre cultivos de tejidos vegetales, seleccione el tipo de fitohormonas y ajuste la dosis de citoquinina y auxina. diferenciación y rápido crecimiento de plántulas. En sentido figurado, este es el mando más sensible.
Después de seleccionar o determinar tentativamente un medio básico, o al mismo tiempo, la proporción de hormonas vegetales suele ser lo primero a considerar. Por ejemplo, utilice medio MS, BA para citoquininas y NAA para auxinas. Dosis: BA se establece tentativamente en 2 mg/1, NAA se establece tentativamente en 0,1 o 0,2 mg/1. Hoy en día, estos medios suelen escribirse como MS+Ba2+NAA 0.1-0.2. La temperatura del cultivo es de 24-26 ℃ y la luz solar es de 10 horas. Este medio de cultivo y sus condiciones han diferenciado con éxito y aumentado el valor de cientos de plantas fácilmente regenerables, por lo que es mejor que lo pruebes primero.
Después de cultivar durante un período de tiempo, la cantidad de hormonas vegetales en el siguiente medio de cultivo se puede modificar en función del rendimiento de la mayoría de los cultivos y de algunos bloques de tejido. Este proceso consiste en recopilar las "opiniones" de la cultura sobre el medio de cultivo y las condiciones de cultivo. Más adelante se presentarán en detalle los problemas que ilustran las diversas manifestaciones de la cultura y cómo ajustarlos.
Puede haber más de una prueba preliminar, como por ejemplo: MS+BA1+NAA0.1, MS+BA3+NAA0.1, etc. Si la respuesta del cultivo no es ideal, puede verificar y consultar las condiciones de cultivo de otras especies de familias, géneros y géneros similares.
La selección de diferentes dosis de hormonas también se puede llevar a cabo mediante dos conjuntos de experimentos de un solo factor: el primer grupo encuentra la dosis adecuada de BA y el segundo grupo encuentra la dosis adecuada de NAA.
El primer grupo es 1—1ms+ba 1+NAA 0.1.
1-2 milisegundos+BA2+NAA0.1
1-3 milisegundos+BA4+NAA0.1
En este conjunto de experimentos, la dosis de NAA Sin cambios, pero se debe observar el impacto de BA en la cultura.
El segundo grupo es 2-1ms+Ba2+NAA0.05.
2-2 MS+BA2+NAA0.1
2-3 MS+BA2+NAA0.5
En este conjunto de experimentos, la dosis de BA Déjelo sin cambios y observe el efecto de NAA en el cultivo.
Un experimento simple como este no requeriría que BA y NAA cambiaran al mismo tiempo. A juzgar por los resultados de la prueba, puede elegir uno o dos tratamientos mejores, o puede predecir las combinaciones que no aparecieron en las dos últimas series de pruebas. La prueba debe ajustarse antes de continuar. Por ejemplo, en el experimento anterior, 1-2 es mejor y 2-3 es mejor. Al repetir el experimento, puede elegir la proporción hormonal de MS+BA2+NAA0.5.
También puede preseleccionar pruebas con grandes cambios en los niveles de medición, lo que significa que los "agujeros del tamiz" de detección son más gruesos y el rango de detección es más amplio. Por ejemplo, BA elige 1, 3, 5 mg/1; NAA es 0,05, 0,5 y 5 mg/1 o 0,01, 0,1, 1, 5,0 mg/1 y así sucesivamente. Una vez que los resultados de este conjunto de experimentos sean claros, la mejor combinación es diseñar una nueva combinación que reduzca el orden de magnitud. Después de dos o tres rondas de experimentos, se encontrará la combinación hormonal óptima.
Para muchas plantas, este experimento es suficiente. En circunstancias especiales, si el problema no se puede resolver, se pueden seleccionar otras citoquininas como KT, ZT, 2-ip y otras auxinas como IAA, IBA, 2,4-D, etc., y realizar experimentos multifactoriales. se puede organizar utilizando experimentos ortogonales y métodos de optimización. Después de experimentos cuidadosos y pacientes, el cerco se fue reduciendo gradualmente y finalmente se encontró el tipo y la dosis adecuados de citoquinina y auxina, lo que permitió que las plantas se reprodujeran sin problemas y a gran velocidad.
Cabe recordar que todos los experimentos deben repetirse 2-3 veces en el mismo medio de cultivo para confirmar su eficacia. Si se hace circular una pequeña cantidad de material de prueba en un medio completamente diferente, los resultados de la prueba no se pueden analizar y no se pueden proporcionar datos reales. La mejor manera es aumentar la carga de trabajo, empezar de nuevo, desinfectar más e inocular más muestras, y probar y observar cuidadosamente.
3. Selección de la concentración de azúcar
La concentración óptima de azúcar se determinó mediante experimento de factor único o experimento ortogonal, combinado con la selección de hormonas vegetales. Generalmente la gama de opciones es pequeña. Para la mayoría de las plantas, una concentración adecuada es de 20 o 30 g/1, y en algunos casos de 40 g/1. En otros cultivos, la diferencia es mayor, a veces 70-150 g/1.
4. Selección del valor de pH
Las plantas generales no tienen requisitos estrictos sobre el valor de pH, como camelia, rododendro, buganvilla, etc., el valor de pH se puede reducir a 5,4. o 5.0. Al probar nuevas especies cultivadas, podemos buscar plantas similares publicadas en el pasado. Al utilizar una prueba de factor único que solo cambia el pH, puede conocer rápidamente el pH apropiado. Primero pruebe PH5.0, 5.4, 5.8, 6.2. Después de que salga el primer resultado, ajuste nuevamente para determinar el valor de pH óptimo.
Durante el proceso de cultivo, el valor del pH del medio de cultivo cambiará con el consumo de nutrientes, por lo que cuando la diferencia de magnitud es demasiado pequeña, la diferencia en los resultados experimentales no será obvia. Mientras el crecimiento y las cualidades ornamentales del cultivo puedan cumplir con los requisitos para una rápida propagación, no hay necesidad de ser demasiado cuidadoso.
5. Temperatura e iluminación
A falta de equipamiento especial, la selección de los requisitos de temperatura e iluminación no necesita ser demasiado detallada. Utilice la parte superior, media e inferior del estante de cultivo para colocar botellas de cultivo y termómetros respectivamente. Después de cultivar durante un período de tiempo, puede comparar el rango de temperatura requerido por las plantas. La necesidad de intensidad de luz se puede comparar por la distancia entre la planta y la fuente de luz. No existe una necesidad especial y el fotoperiodo generalmente no se estudia. La mayoría de los expertos creen que son necesarias entre 10 y 14 horas de luz.
Las unidades con condiciones pueden adquirir cajas aislantes livianas. Este dispositivo puede controlar con precisión el tiempo de iluminación diario, es decir, los cambios periódicos de luz y oscuridad se pueden controlar arbitrariamente y la intensidad de la luz se puede ajustar según la cantidad de luces. Equipado con dispositivos de calefacción y refrigeración, regulables en cualquier rango de +1°C. Las incubadoras de luz son equipos ideales para estudiar los efectos de la vernalización del cultivo y el fotoperíodo en el desarrollo de las plantas. La humedad en la caja generalmente solo se puede ajustar, pero esta relación no es muy importante porque la humedad en la botella de cultivo generalmente es del 100%. Si se usa adecuadamente, en tales condiciones experimentales, varios de los factores más importantes que pueden afectar el crecimiento y desarrollo de las plantas se controlan artificialmente. Este es un dispositivo ideal para un control preciso a nivel microscópico completo, a nivel de tejido u órgano y a nivel celular. Con este tipo de incubadora de luz, puedes conocer rápida y fácilmente la temperatura óptima y las condiciones de luz necesarias para que una determinada planta se reproduzca rápidamente.
6. Determinación final de factores integrales
Después de encontrar las condiciones óptimas para cada factor, combine estas condiciones óptimas para un experimento integral. El trabajo experimental se puede concluir basándose en el. resultados experimentales, para promover los resultados de la investigación y aplicarlos a la reproducción rápida a gran escala.