En los últimos años, con la alta incidencia de tumores malignos, la epidemia de SIDA, el uso generalizado de fármacos quimioterapéuticos, antibióticos de amplio espectro, glucocorticoides e inmunosupresores, así como catéteres artificiales y órganos Con la aplicación de tecnologías diagnósticas y terapéuticas invasivas como los trasplantes, las infecciones causadas por hongos se han convertido cada vez más en un enorme desafío al que se enfrentan los departamentos clínicos.
Para mejorar el nivel de diagnóstico clínico, es muy importante fortalecer las capacidades de pruebas fúngicas. Los problemas comunes en las pruebas de hongos en los laboratorios de microbiología clínica se resumen a continuación para su referencia.
1. ¿Por qué se debe fijar el cultivo a 35°C?
Para evitar que las fluctuaciones de temperatura afecten al crecimiento de bacterias u hongos, los laboratorios suelen ajustar la temperatura de la incubadora a 35°C. La temperatura óptima de crecimiento de las bacterias clínicas comunes es de 33 a 37 °C (excepto las bacterias termófilas y mesófilas, que representan una minoría). Cuando se establece a 35°C, el cultivo no se verá afectado por una fluctuación de 2°C. Si se fija en 37°C, obviamente es inapropiado. En cuanto al cultivo de hongos, depende del origen del espécimen.
Aislar y cultivar muestras como raspados de piel, raspados de uñas, caspa y cabello sospechosos de infección fúngica superficial. La temperatura del cultivo es de 26 ~ 28 ℃. Se recomienda cultivar muestras de tejidos humanos profundos, como esputo, derrame pleural, sangre, abscesos profundos de la médula ósea, etc., a 35 °C, que es una temperatura más cercana a la del cuerpo humano. En segundo lugar, la Candida albicans clínica más común puede formar colonias de pseudopodophyllum relativamente típicas a 35°C, que es lo mismo que la prueba de germinación en suero a 35°C.
Al mismo tiempo, Candida glabrata aislada a 35°C tiene mayor actividad enzimática. Si se sospecha una infección fúngica bifásica de tipo térmico o si un solo hongo necesita crecer a una temperatura más alta, ambas temperaturas deben cultivarse simultáneamente. También preste atención a la humedad del ambiente de cultivo, que generalmente se requiere que sea superior al 60%. Si la incubadora no tiene suficiente humedad, lo mejor es colocar un recipiente con agua esterilizada cerca de la placa para asegurar la humedad.
2. ¿El CO2 tiene un gran impacto en el crecimiento de los hongos?
Los hongos son microorganismos heterótrofos que obtienen principalmente fuentes de carbono a partir de materia orgánica, mientras que los microorganismos autótrofos sólo necesitan obtener fuentes de carbono a partir de CO2, por lo que generalmente los hongos no necesitan ser cultivados en un ambiente sin dióxido de carbono. Favorece el crecimiento y la reproducción de hongos, pero ciertas concentraciones pueden estimular la formación de esporas.
3. Se cultivaron hongos dos veces en hemocultivo, pero el niño no presentó manifestaciones clínicas. No se utilizaron medicamentos antimicóticos clínicamente y el niño estaba en buenas condiciones. ¿Es la contaminación un problema?
En este caso, es necesario determinar si se trata de bacterias contaminantes, investigar si el proceso de extracción de sangre está estandarizado, si el proceso de transferencia de la botella de sangre cumple con los requisitos, si el orificio está bien sellado, si el la caja de transferencia está contaminada y muchos otros factores. Lo más importante es la presentación clínica del paciente. Si no hay síntomas de infección por hongos, se debe considerar la contaminación o colonización (poco probable).
4. En el trabajo real en nuestros hospitales primarios, es casi imposible realizar una identificación bioquímica mediante cultivo de secreciones vaginales, y muchas personas informan directamente sobre Candida albicans. ¿Es esto apropiado?
Esto es inapropiado. Hoy en día, algunos departamentos de laboratorio ni siquiera pueden distinguir entre levadura y moho. Si se encuentra Candida en las secreciones vaginales, la orina y las heces al microscopio, lo informarán como "encontrado moho".
El moho se refiere a hongos multicelulares filamentosos; la levadura se refiere a hongos unicelulares y no se pueden confundir ambos. La mayoría de las infecciones por hongos en la vagina son Candida albicans, pero no se excluyen otras levaduras.
El azafrán Candida es naturalmente resistente al fluconazol y a la 5-fluorocitosina. Si encuentra cepas similares que son naturalmente resistentes, afectará el tratamiento posterior.
5. ¿Es necesario reflejar en el informe la presencia de una pequeña cantidad de Candida en la muestra de esputo? ¿Aún no lo reportas?
Los requisitos de las muestras y los procedimientos de examen deben reflejarse y los médicos los considerarán de manera integral. Aunque la probabilidad de que Candida albicans cause infecciones pulmonares por hongos es rara, se recomienda a los médicos informar y considerar este hongo junto con los hallazgos de las imágenes.
Las muestras de frotis deben tomarse directamente de muestras de esputo en etapa tardía. Si la calidad de la muestra es calificada, si se observan hilos de hongos, pseudohifas o una gran cantidad de esporas o crecimiento de hongos en el cultivo de esputo, el informe debe informarse al médico para su consideración integral. En cuanto a si realizar pruebas de sensibilidad a los medicamentos, puede decidirlo después de comunicarse con su médico.
① Se recomienda enjuagar la boca con agua con gas al 5% antes de tomar la muestra
② El primer esputo de la mañana
③ Si el; Los resultados del envío de imágenes 3D son consistentes.
Lo mejor es comunicarse con los médicos o brindar capacitación a los médicos y enfermeras sobre los métodos de recolección de muestras. Antes de informar, junto con los resultados de la baciloscopia de esputo, preste atención a la información sobre la calidad de la muestra y la posibilidad de contaminación.
6. Me gustaría preguntar: Hace unos días, encontré accidentalmente una muestra de pus extraída, que fue captada mediante hemocultivo. Después de un informe positivo, un frotis mostró esporas de hongos. Después de la transferencia, el frotis mostró una forma redonda y una tinción de tinta positiva, pero sin encapsulación. Después de la transferencia, el Komaga no tiene color y el blanco está un poco amarillo. Esto demuestra que es casi suave y sensible a las drogas. La pregunta es: ① ¿Es creíble este resultado? ②¿Importa si la tinta es jugo normal? ③¿Cómo mejorar?
La tinción con tinta es una prueba de tinción negativa para criptococos en muestras, especialmente la cápsula de Cryptococcus neoformans, y no puede utilizarse como prueba de identificación para cultivo puro de criptococos.
(1) Realice una biopsia húmeda con KOH al 10% en la muestra de pus anterior para buscar esporas de hongos e hifas verdaderas y falsas.
(2) Los resultados del cultivo deben ser creíbles y lo mejor es comunicarse con el médico para ver si el paciente presenta síntomas.
(3) Si no está familiarizado con una determinada marca nacional, es difícil juzgar los resultados de identificación y los resultados de sensibilidad a los medicamentos.
(4) De acuerdo con los procedimientos operativos nacionales, se prepararon tubos bioquímicos para identificar Candida. El índice de cumplimiento para la identificación de hongos controlado por el antiguo Ministerio de Salud sigue siendo muy bueno. Puede considerar fabricar sus propios tubos bioquímicos y utilizar bacterias de control de calidad para la verificación.
(5) Utilice cada número de lote para verificar las bacterias de control de calidad de un tubo de identificación doméstico. Si los resultados son consistentes, no debería haber ningún problema.
(6) Lo mejor es participar en la capacitación de control de calidad microbiológica del ex Ministerio de Salud, que te ayudará a mejorar tu nivel empresarial y verificar la calidad de los reactivos que utilizas, ya sean bacterias o levaduras. .
(7) Mientras la tinta tenga un espesor uniforme, cuanto más finas sean las partículas, mejor. Se recomienda la tinta Cao Sugong, que se puede adquirir en una empresa de reactivos.
7. ¿Cómo se desarrolla el proceso después de que se detecta por primera vez Aspergillus en muestras clínicas comunes de esputo?
(1) Cuando se cultivan colonias de hongos filamentosos a partir de muestras de esputo por primera vez, la premisa es que las muestras de esputo son frescas o no pueden enviarse para su examen inmediatamente y deben almacenarse en un refrigerador a 4°C. .
El proceso es la aceptación de la muestra de esputo→examen microscópico→cultivo→identificación.
Una vez calificada la muestra de esputo, primero realice una microscopía de película húmeda con KOH al 10% y busque hifas de hongos bajo un microscopio de baja potencia para ver si son transparentes u oscuras y si hay ángulos de 45 grados. sucursales.
Si la muestra de esputo es calificada y se encuentran hifas, llame a la clínica e informe al médico que hay un hongo filamentoso creciendo y que se sospecha que es XXXX. Es fácil informar directamente a la clínica, es difícil cultivar placas de agar Shaker o placas de agar Chaz y luego identificar el progreso.
(2) Si la muestra no está calificada o calificada, pero no se encuentran hifas en la muestra, comuníquese con el médico por teléfono e informe al médico de la presencia de crecimiento fúngico para que pueda considerarlo. exhaustivamente. La identificación se realizó con normalidad y se informó a la clínica. Estas observaciones no descartan la posibilidad de contaminación.
8. ¿Por qué la prueba de asimilación de la levadura se establece a 28 ℃ en lugar de 35 C? ¿Cuál es la diferencia entre una prueba de asimilación y una prueba de fermentación? ¿Por qué el libro de texto dice que cualquiera que pueda fermentar un determinado azúcar debe asimilarlo, pero quien puede asimilar un determinado azúcar no necesariamente lo fermenta?
La temperatura óptima de crecimiento in vitro de la mayoría de las levaduras es de 28-30°C, por lo que se seleccionó esta temperatura para los experimentos in vitro. La transformación y la fermentación se refieren a la respiración aeróbica y la glucólisis anaeróbica de los hongos, respectivamente. El primero descompone el azúcar en dióxido de carbono y agua, y el segundo descompone el azúcar en dióxido de carbono y alcohol.
Su metabolismo es primero respiración aeróbica para obtener energía, y luego glucólisis anaeróbica, que está determinada por enzimas relacionadas de bacterias y hongos. La mayoría de las levaduras son bacterias aeróbicas obligadas, por lo que el diseño experimental se basa principalmente en experimentos de asimilación de azúcares. Por ejemplo, Cryptococcus sólo puede respirar aeróbicamente, por lo que sólo puede asimilar glucosa pero no puede fermentar, mientras que Saccharomyces cerevisiae puede fermentar el grano hasta convertirlo en vino, fermentando y asimilando glucosa.
9. Considerando que el cultivo de hongos actual no está muy estandarizado, ¿cómo elegir el medio de cultivo, la temperatura, el tiempo de informe y el método? Describa los procedimientos específicos del laboratorio.
(1) Medio: agar dextrosa de Sheikh, agar dextrosa de patata, agar de extracto de cerebro y corazón y otros medios adecuados para el crecimiento de hongos. Se sospecha clínicamente de infecciones por levaduras y bacterias similares. Si las condiciones lo permiten, el laboratorio puede inocular en paralelo los medios cromogénicos. Se recomienda utilizar el método de cultivo inclinado en tubo espiral. Después del procesamiento, las muestras se inoculan en la parte media e inferior del medio de cultivo. Para la mayoría de las bacterias aeróbicas, se recomienda inocular dos tubos en paralelo.
(2) Condiciones de cultivo y tiempo de informe: los hongos profundos deben cultivarse a 28 ± 65438 ± 0 ℃ durante 7 ~ 65438 ± 04 días. Si se sospecha una infección fúngica bifásica, se debe realizar un cultivo simultáneo a 28°C y 35°C a 65438±0°C.
Si se sospecha una infección fúngica rara, se han utilizado hongos de crecimiento lento o fármacos antimicóticos clínicos, el período de observación debe ampliarse durante al menos 4 semanas.
Por ejemplo, el líquido cefalorraquídeo debe cultivarse a 28 °C y 35 °C durante al menos una semana.
El esputo, la orina y las heces generalmente se pueden cultivar a 35 °C durante 48 horas. Si no hay crecimiento de hongos filamentosos, se ampliará el tiempo de incubación.
Las muestras de tejido normalmente se almacenan a 30°C durante 2 a 4 semanas.
10. ¿Se puede utilizar el medio cromogénico Comaga como medio de cultivo primario para hongos?
Como uno de los medios primarios, se recomienda inocular medio Sabouraud o medio nitrogenado de levadura (YPDA). SDA e YPDA son generalmente medios estándar para bacterias similares a levaduras.
11. ¿Tiene sentido cultivar hongos a partir de hisopos de garganta?
El cultivo de hongos a partir de hisopos de garganta tiene poca importancia a menos que el paciente tenga manifestaciones clínicas; de lo contrario, habrá colonización.
12. Me gustaría preguntar si la tasa de colonización de Candida en las muestras de esputo es tan alta, ¿cómo puedo informar que hay tantas esporas y pseudohifas en el frotis de esputo?
Personalmente, creo que todavía es necesario informar sinceramente al médico e informarle si la calidad de la muestra es aceptable. En cuanto a si existe infección, los médicos la considerarán en función de los datos de imágenes y las manifestaciones clínicas del paciente.
13. El paciente presentaba pápulas tipo eczema en las manos, lo que se sospechaba de infección por hongos. ¿Cómo puedo tomar una muestra?
Para la recolección de lesiones cutáneas, primero es necesario desinfectar el área afectada con alcohol al 70%, luego usar un raspador o bisturí de acero inoxidable esterilizado para raspar los raspados de piel en el borde de la lesión cutánea y Ponlo en un recipiente esterilizado. Compruébalo.
14. ¿Se pueden utilizar guantes desechables para las tabletas de SDA?
Los guantes desechables, ya sean PV o látex, crearán un ambiente relativamente bajo en oxígeno, y los hongos son bacterias aeróbicas, que afectarán el crecimiento de los hongos. Esta operación no se recomienda.
Puedes utilizar cinta transpirable (que se utiliza para fijar las agujas de infusión intravenosa) para sellar la placa, pero ten cuidado de no sellarla demasiado.
15. La tinta utilizada bajo el microscopio no tiene un fondo negro uniforme, sino algunas pequeñas partículas negras. ¿Es esta tinta de mala calidad? Además, ¿cuáles son las diferencias entre las cabinas de seguridad biológica, las cabinas de banco limpio y las campanas extractoras?
La tinta en sí se forma añadiendo unas pequeñas partículas al disolvente. La calidad de la tinta radica en el tamaño y la uniformidad de las partículas.
Generalmente se debe observar al utilizar tinta para detectar Cryptococcus. Solo sirve como fondo. La cápsula está sin teñir y es transparente, mientras que el fondo es negro.
La diferencia entre una cabina de seguridad biológica y un banco de trabajo limpio radica en la dirección del viento:
La dirección del viento de la cabina de seguridad biológica es primero verticalmente hacia abajo y luego entra en la cabina. y se descarga después del filtrado y la circulación HEPA, formando un ambiente de presión relativamente negativa en el gabinete;
La dirección del viento del banco de trabajo limpio es primero hacia abajo y luego sopla hacia afuera para garantizar que el gabinete esté limpio y. libre de polvo. Generalmente se usa para configurar paneles planos y operar algunos experimentos simples relacionados con la clonación molecular.
La campana extractora expulsa el aire del interior del gabinete al exterior del laboratorio a través de un ventilador. El ventilador se utiliza generalmente para preparar reactivos químicos volátiles y descargar gases nocivos al exterior.
16. ¿Cuál es el significado clínico de ver cabezas de Aspergillus en el frotis de esputo? ¿Existe alguna posibilidad de contaminación por Mucor? ¿O un valor fijo? Se detectó Penicillium en el esputo, ¿no significa nada?
Si se encuentran cabezas de Aspergillus en muestras de esputo bajo microscopía directa, se debe considerar la posibilidad de infección por Aspergillus. El cultivo puede determinar de qué especie de Aspergillus se trata.
Mucor tiene potencial para contaminar y también puede existir en el aire. Sin embargo, debido a su alta invasividad, los informes deben ser cautelosos y la posibilidad de establecer un valor fijo es muy pequeña, pero todavía hay muchos casos de contaminación en las operaciones. Si la muestra está calificada y la microscopía de película húmeda muestra ramas de 90 grados e hifas gruesas e indivisas, se debe considerar; de lo contrario, existe la posibilidad de contaminación y es mejor comunicarse con el médico a tiempo.
Penicillium es un hongo patógeno oportunista. Si se detectan hifas directamente en el esputo mediante microscopía y el cultivo es positivo, se debe considerar la posibilidad de infección.
17. En la etapa inicial de acumulación de experiencia, ¿cómo obtener suficientes cepas bacterianas para practicar diversas tinciones y lecturas de películas?
Si es posible, lo mejor es acudir a la sala de hongos del hospital correspondiente para realizar una microscopía húmeda adicional e identificar los hongos. Después de transferir las cepas conservadas en lotes, estudie cuidadosamente los cambios en el color, tamaño, textura y examen microscópico de las colonias, y mantenga registros. O asista a una clase de formación profesional sobre hongos medicinales para un aprendizaje sistemático.
18. ¿Cómo conservar las cepas de hongos?
El mejor método es el secado al vacío y la congelación criogénica. Este método es adoptado por instituciones internacionales de recolección de cultivos.
(1) La congelación directa de la pendiente de crecimiento a -10°C no es adecuada para la conservación de dermatofitos y muchas especies de zigomicetos.
(2) Método de conservación con agua destilada: raspe el micelio, las esporas o las células de levadura de las colonias maduras que crecen en un medio de glucosa de papa o enjuague la pendiente con agua destilada estéril, luego succione con una pipeta y colóquela Colóquelo en un vial estéril, ciérrelo para evitar la evaporación y guárdelo a temperatura ambiente.
(3) Otro método consiste en añadir aceite mineral estéril directamente a la pendiente de agar donde crece el moho, que se puede almacenar durante al menos medio año.
(4) Agregue entre un 15 % y un 30 % de glicerol al medio de cultivo líquido básico, recoja colonias maduras frescas y guárdelas a -80 °C.
19. Ya sea una infección por hongos o no, ¿en qué tipo de pacientes nos centraremos?
Pacientes con inmunodeficiencias, pacientes trasplantados de órganos, pacientes con tumores, pacientes neutropénicos y pacientes que utilizan antibióticos de amplio espectro durante un tiempo prolongado.
20. ¿Qué debo hacer si la incubadora de moho (28C) está contaminada? Las bacterias contaminadas crecen rápidamente después de colocar el medio de cultivo en la incubadora, especialmente en el sello de la puerta. ¿Qué debo hacer?
Después de un corte de energía, fumigue formaldehído, limpie con fenol (ácido carbólico) al 5% durante 30 minutos, limpie con agua limpia y ventile durante 24 horas antes de su uso.
21. ¿Qué hongos filamentosos se pueden cultivar a partir de hemocultivos? ¿Qué es la contaminación?
Los principales hongos filamentosos con hemocultivo positivo incluyen Histoplasma, Marneffei, Fusarium, Candida, Cryptococcus, Trichosporon y Scedosporium. Paecilomyces violaceum se cultivó en tejido de globo ocular humano (molido y colocado en frascos de hemocultivo). El líquido ascítico se bombeó a frascos de hemocultivo para cultivar Pythium braunii.
Los informes publicados indican que Blastomyces dermatitidis, Aemon y la coccidiosis pueden cultivarse a partir de hemocultivos.
Aspergillus fumigatus está contaminado y se ha informado que Aspergillus terreus se cultivó a partir de sangre periférica de pacientes con endocarditis [I Clin microbiol 1998 nov 36(11):3347-51].
22. Se presenta un caso de paciente respiratorio, masculino, 61 años, con diagnóstico de bronconeumonía, HI IV negativo y cultivo de esputo calificado que mostró cianobacteria Marneffei 3+. ¿Se puede diagnosticar? ¿Es necesario un nuevo examen?
¿Es hepatoesplenomegalia? ¿Hay algún hueso involucrado? ¿Hay alguna afectación de la piel? ¿O simplemente se limita a los pulmones? ¿Tiene el paciente otras condiciones médicas subyacentes?
Se recomienda enviar nuevamente la muestra. Si se cultiva Blue Marnife repetidamente se debe estar atento. El Penicillium marneffei cultivado a partir de esputo debe considerarse un hongo patógeno.
La diferencia entre Cyanobacterium marneffei y Aspergillus;
Si en muestras clínicas directas (in vivo), Cyanobacterium marneffei es una espora parecida a una levadura, mientras que Aspergillus es un micelio con ramas separadas en ángulos de 45 grados.
Por ejemplo, la cianobacteria Marneffei puede aparecer de color amarillo claro o amarillo verdoso cuando se cultiva a 28 °C in vitro, con el dorso rojo y un pigmento rojo impregnando el medio de cultivo.
Aspergillus es; blanco al principio. La superficie puede tener partículas de diferentes colores para identificar cuáles son Aspergillus.
El hongo azul Marnife puede ver la rama de la retama, y el Aspergillus puede ver la cabeza del Aspergillus.
La fuente del contenido anterior: "Examen e ilustración de hongos medicinales" editado por Lu Hongzhou, Qian Xueqin y Xu Heping.
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