Principio: La glicosilación conduce a la pérdida de cationes en la superficie de las moléculas de hemoglobina. En intercambiadores de cationes débiles, como Biorex70, la hemoglobina glucosilada se eluye antes que la hemoglobina no glucosilada, con un aumento de la concentración de iones y/o una disminución del pH. Este fenómeno dio origen al término original "hemoglobina rápida" para la hemoglobina glucosilada. La cromatografía de intercambio catiónico se puede utilizar en cromatografía de columna pequeña, micro o grande o en métodos PHLC/FPLC parcial o totalmente automatizados. Dado que otras hemoglobinas modificadas postraduccionalmente, como el tipo aldimina, formilación, acetilación, aductos de acetaldehído, productos de degradación, artefactos de envejecimiento, intercambio anormal de carga de hemoglobina, etc., también son diferentes de la HbA0 normal, los cationes se enumeran como muchos factores de interferencia en la cromatografía de intercambio. Utilice métodos HPLC convencionales. La separación de subfracciones de hemoglobina glicosilada puede lograr la precisión clínica requerida. Sin embargo, se sabe que el pico de HbA1c no es uniforme sino que contiene una importante fracción de hemoglobina no glicosilada. Una pequeña cantidad de hemoglobina glucosilada también se integra en el pico principal de HbA0. El efecto de separación se puede mejorar utilizando un material de columna especial (poly-CATA) y un tiempo de separación de 30 a 40 minutos. Estos métodos pueden utilizarse como procedimientos de referencia, pero no son adecuados para uso rutinario. Toda cromatografía de intercambio catiónico es sensible a los cambios de pH y temperatura, por lo que se deben controlar el pH y la temperatura.
Nota: Según la cinética metabólica de los glóbulos rojos, se estima que el valor inicial de HBA a 1°C es aproximadamente 1/120 (≈0,83%) por día. Dado que la glicación se produce incluso en individuos sanos con el tratamiento adecuado, este valor teórico no se puede alcanzar in vitro. Los pacientes diabéticos con un control insatisfactorio del azúcar en sangre pueden alcanzar niveles normales de azúcar en sangre mediante un tratamiento intensivo. Se puede encontrar que la tasa máxima de disminución del valor de HbA1c cada 10 días (valor absoluto) es aproximadamente el 1% del nivel normal de azúcar en sangre. Debido a la precisión del método utilizado para medir la hemoglobina glucosilada, la diferencia entre las dos mediciones de HbA1c es aproximadamente del 1%, lo que puede considerarse clínicamente relevante. Por estos motivos, debe transcurrir al menos 2 semanas entre dos mediciones de HbA1c y se recomienda un intervalo de 4 a 6 semanas.
Debido a que los valores elevados de hemoglobina glucosilada son un indicador fiable de hiperglucemia crónica en pacientes diabéticos, es posible diagnosticar la diabetes. En personas no tratadas, los valores normales de HbA1c descartan una diabetes clínicamente manifiesta. Sin embargo, el uso de hemoglobina glicosilada como único parámetro con fines de diagnóstico y/o detección es problemático porque no detecta una tolerancia anormal a la glucosa.
2. Electroforesis
Principio: en comparación con la hemoglobina no glicosilada, el cambio en la carga total y el punto isoeléctrico de la hemoglobina glicosilada es un gel de agarosa o un gradiente de pH de 5,0 ~ 6,5. de separación por electroforesis por enfoque isoeléctrico en gel. La resolución de las subfracciones de hemoglobina en la electroforesis en gel de agarosa es muy pequeña, pero el enfoque isoeléctrico puede separar mejor las subfracciones. Quizás por la falta de automatización en los experimentos, la importancia se reduce.
3. Cromatografía de afinidad
Principio: El ácido bórico se combina con el grupo cis-hidroxilo. Las columnas de afinidad comerciales con valencia de agarosa del ácido m-aminofenilborónico se pueden utilizar para el análisis y la detección de microcolumnas. Después de agregar la hemoglobina de la muestra de sangre a la columna de cromatografía, toda la hemoglobina glucosilada (HbA1 y hemoglobina glucosilada de cadena lateral; hemoglobina glucosilada total) se combina con ácido bórico, pero la columna cromatográfica no puede medir la hemoglobina glucosilada. Tras la adición de altas concentraciones de complejos polihidroxi tales como sorbitol, que también contiene grupos cis-hidroxilo, la combinación de hemoglobina glicosilada y ácido bórico se desplaza y eluye de la columna. La cromatografía de afinidad es relativamente insensible a los efectos de la hemoglobina modificada postraduccional y la hemoglobina patológica. Sólo la hemoglobina glicosilada total puede determinarse mediante cromatografía de afinidad. El método de cromatografía de afinidad ampliamente utilizado permite que un algoritmo empírico calcule la "HbA1c estándar" a partir de los valores de hemoglobina glicosilada total.
4. Inmunoensayo
La hemoglobina glicosilada β-N-terminal de valina proporciona un epítopo que es fácilmente reconocido por los anticuerpos. Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales para radioinmunoensayos y análisis inmunoenzimáticos. Los anticuerpos reconocen específicamente el epítopo que consta de los últimos 4 a 8 aminoácidos de la hemoglobina glicosilada N-terminal de la cadena β. No hay interferencia por hemoglobina anormal o hemoglobina modificada postraduccionalmente.
Las pruebas inmunoquímicas actuales no sólo detectan la HbA1c, sino que también pueden detectar la HbA2c al mismo tiempo, porque el epítopo de la cadena delta glicosilada de la hemoglobina A2 es el mismo. Para la detección también se pueden utilizar pruebas inmunoquímicas con anticuerpos dirigidos contra epítopos glicosilados de los últimos cuatro aminoácidos de la cadena beta, como la HbS1c.
En la mayoría de los casos, la HbA2c tiene poca importancia. Aunque el grado de glicosilación del extremo β-N-amino de la valina se puede medir con precisión en la anemia de células falciformes, todavía no se puede utilizar para representar la HbA1c al 100%.
5. Cromatografía iónica
La cromatografía iónica tiene las ventajas de una alta precisión, buena repetibilidad y un funcionamiento sencillo, y se ha utilizado ampliamente en la práctica clínica. Principio de detección: dado que la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina glucosilada tiene cargas diferentes, la hemoglobina glucosilada total (GH b) y H bA tienen propiedades catiónicas en soluciones ácidas, por lo que pueden acidificarse al pasar a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico. La resina equilibrada con tampón se adsorbe, pero sus velocidades de adsorción son diferentes: la GH b tiene menos carga positiva y la H bA se adsorbe a una velocidad mayor. La GH b y la H bA pueden eluir mediante tampones de fosfato con diferentes valores de pH, y la H b puede convertirse en metahemoglobina mediante KCN y medirse con un espectrofotómetro. O obtenga el cromatograma de H b correspondiente, la abscisa es el tiempo y la ordenada es el porcentaje. Los valores de HbA1c se expresan en porcentaje. Actualmente, la mayoría de ellos se miden mediante instrumentos de medición automáticos.
6. Método de agregación de puntos isoeléctricos
Es una nueva tecnología para medir GH B. Utiliza un medio portador anfótero en un gel de ftalato poliacrílico para formar un portador en una placa delgada de El ánodo, al aumentar gradualmente el gradiente de pH del cátodo, cada componente de la sangre hemolizada se moverá a la posición de pH de su propio punto isoeléctrico, obteniendo así un mejor efecto de separación y una banda de color más concentrada que el método de electroforesis general. Al escanear con un microdensitómetro de alta resolución, se puede determinar con precisión la cantidad de cada ingrediente. Dado que se pueden distinguir HbA, HbAc, HbF, HbS y HbC con diferentes estructuras primarias, se pueden evitar por completo las interferencias de diversas sustancias.
7. Método de quimioluminiscencia
Utilice el método de inmunoensayo de captura de iones, aplique el principio de reacción antígeno-anticuerpo, combine con marcadores fluorescentes y conecte el complejo de polianión cargado negativamente al adsorbido en el. Superficie de fibra cargada positivamente. Después de una serie de pasos de lavado minuciosos, se determina la tasa de cambio en la intensidad de la fluorescencia y se calcula la concentración. Utilizando kits especiales y analizadores inmunoluminiscentes, el sistema de detección es fácil de estandarizar y repetir, puede reducir errores técnicos en las operaciones, tiene alta sensibilidad y especificidad, pequeños coeficientes de variación intra e interlotes, alta tasa de recuperación, alta precisión y compatibilidad cruzada. tasa de contaminación Baja, hay pocos factores que influyen.
8. Método enzimático
El principio es que la H b se descompone mediante una proteasa especial y los fructosilaminoácidos se separan de la HB en 3 a 5 minutos. La glicosil aminoácido oxidasa (FAOD) produce H2O2, H2O2 fructosil aminoácidos y el H2O2 reacciona con DA-64 a través de POD. La concentración de GHb se determinó midiendo la absorbancia a 7565438 ± 0 nm.