Papel de ingeniería celular
La ingeniería celular es un aspecto importante de la bioingeniería. En general, aplica las teorías y métodos de la biología celular y la biología molecular para llevar a cabo operaciones genéticas a nivel celular y cultivos de células y tejidos a gran escala de acuerdo con los planos de diseño de las personas. A continuación se muestran los artículos de ingeniería celular que compilé para usted, bienvenido a leer.
Resumen Objetivo: Preparar un andamio de ingeniería de tejido muscular descelularizado y probar su biocompatibilidad con células epiteliales de la membrana amniótica humana. Métodos Se utilizó un método de extracción química que combina TNT y dodecilsulfato de sodio para preparar un andamio de ingeniería de tejido muscular descelularizado, y su estructura se observó en secciones congeladas. Después de sembrar células epiteliales amnióticas humanas en el andamio y cultivarlas durante 7 días, se usó inmunohistoquímica para detectar la actividad de proliferación de las células epiteliales amnióticas y la expresión de NT3 y BDNF, y se observó su ultraestructura con un microscopio electrónico de barrido. Resultados: Las células del andamio se eliminaron por completo y su estructura principal era una estructura tubular dispuesta en paralelo. Las fibras elásticas y las fibras de colágeno, los principales componentes de la matriz extracelular, permanecen intactas. Las células epiteliales amnióticas tienen actividad proliferativa en la estructura y muestran inmunorreactividad positiva para NT3 y BDNF. La microscopía electrónica de barrido mostró que las células epiteliales de la membrana amniótica estaban distribuidas uniformemente en el andamio y crecían bien. Conclusión Se produjo con éxito un andamio de ingeniería de tejido muscular descelularizado que tiene buena compatibilidad con las células epiteliales amnióticas humanas.
Palabras clave: músculo descelularizado; células epiteliales amnióticas humanas; biocompatibilidad
Uno de los avances importantes en la investigación de ingeniería de tejidos en los últimos años es el uso de injertos autólogos o alogénicos para fabricar materiales naturalmente biodegradables. para andamios de ingeniería de tejidos. Entre ellos, los injertos descelularizados tienen buena biocompatibilidad con el organismo. Los andamios musculares descelularizados pueden servir como andamios de bioingeniería para apoyar la regeneración de los axones de las células nerviosas. Mligiliche et al. [1] trasplantaron músculo descelularizado en el defecto del nervio ciático de ratas y descubrieron que una gran cantidad de axones nerviosos habían crecido en la estructura del músculo descelularizado 4 semanas después. Dado que la aplicación de estructuras musculares descelularizadas por sí solas tiene un efecto limitado en el tratamiento de enfermedades neurológicas, para que las estructuras musculares descelularizadas desempeñen un papel más importante, a menudo es necesario implantar células semilla en las estructuras [2, 3]. Los estudios han demostrado que las células epiteliales amnióticas pueden secretar una variedad de factores neuronales [4,5], promover el crecimiento de los axones neuronales y son una buena célula semilla para el tratamiento de enfermedades neurológicas. Este estudio utilizó la descelularización química para preparar estructuras musculares acelulares y sembró células epiteliales de la membrana amniótica en las estructuras musculares descelularizadas para explorar la compatibilidad de las dos y proporcionar una nueva forma de llevar a cabo la ingeniería de tejidos para tratar enfermedades neurológicas.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales
1.1.1 Animales experimentales Las ratas Wistar fueron proporcionadas por el Centro Experimental de Animales de la Facultad de Medicina Bethune de la Universidad de Jilin.
1.1.2 Reactivos El medio IMDM y el suero de ternera fueron proporcionados por Hyclone. Los anticuerpos monoclonales 5'bromouridina (BrdU) y BrdU se adquirieron de Neomarker neurotrophin (NT) 3, los anticuerpos policlonales antihumanos de conejo del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se adquirieron de Wuhan Boster Company, el kit de inmunohistoquímica SABC se adquirió de Fuzhou Maixin. Empresa de Biotecnología. En nuestro laboratorio se conservan líneas celulares epiteliales amnióticas humanas.
1.2 Métodos
1.2.1 La preparación de andamios musculares descelularizados se refiere al método de preparación de vejiga descelularizada de Brown et al [6]. Wistar grande El músculo serrato de ratón se colocó en agua destilada y se agitó en un agitador a 37°C y 50 r/min durante 48 h, luego se transfirió a una solución de TritonX100 al 3 % y se agitó en un agitador a 37°C y 50 r/min. durante 48h. Luego ponerlo en agua destilada y agitar en un agitador a 37°C y 50 r/min durante 48 horas. Cambiar a solución de SDS al 1% y agitar a 37°C y 50 r/min durante 48 h. Lavar con PBS durante 24 h. Almacenar en PBS a 4°C para su uso posterior.
1.2.2 Observación de la estructura morfológica e identificación de componentes del andamio Observar la morfología del músculo descelularizado a simple vista. Los músculos descelularizados se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 1 h, sacarosa al 5% durante 90 min, sacarosa al 15% durante 90 min y sacarosa al 30% durante la noche para una deshidratación en gradiente, se incluyeron en OCT, se congelaron rápidamente en acetona fría y luego almacenado en refrigerador a -70°C.
Cortar en secciones con un microtomo criostato, teñir con HE y observar la estructura interna. Además, se realizaron tinciones de Van Gienson (VG) y tinciones de Weigert (tinciones VG+ET) en las secciones para detectar los componentes de la matriz extracelular del andamio.
1.2.3 Cultivo de células epiteliales amnióticas humanas Se cultivaron células epiteliales amnióticas humanas en DMEM (que contiene suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, glutamina 200 μg/ml). ), cultivo en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, 5 % de CO2 y humedad saturada. Cambie el medio cada dos días. Después de que las células del cultivo en monocapa crezcan hasta un 80 % de confluencia, subcultive.
1.2.4 Identificación de la compatibilidad de las células epiteliales amnióticas humanas y los andamios musculares descelularizados
1.2.4.1 Tome células epiteliales amnióticas humanas bien desarrolladas, el 80% de las células están cerca de fusión, deseche Retire el medio de cultivo y digiéralo con tripsina al 0,25%. Cuando el cuerpo celular se retraiga y el espacio intercelular se ensanche, use suero para detener la digestión. Sople suavemente las células en la pared de la botella para formar una sola célula. suspensión en un tubo de centrífuga, 1000 r/min. Centrifugar durante 3 minutos. Resuspender las células en DMEM. Utilice una jeringa de 1 ml para inhalar la suspensión celular, inyéctela en el andamio de músculo descelularizado a una densidad de 2×106/ml, distribúyala en una placa de 24 pocillos y cultívela en una incubadora de cultivo celular a 37°C. 5% de CO2 y humedad saturada. Cambiar el medio todos los días y cultivar durante 1 semana. Se añadió Brdu (concentración final: 10 mg/L) y, después de continuar el cultivo durante 1 día, las células se cortaron con un microtomo criostato (el método es el mismo que antes). Después de lavar las secciones con PBS, se inactivó la peroxidasa endógena con H2O2 al 3% durante 10 minutos y se bloqueó con suero durante 20 minutos. Los anticuerpos primarios fueron el anticuerpo monoclonal BrdU (dilución 1:1000), el anticuerpo policlonal BDNF y NT3 (1:1000); dilución). con DAB. Observar bajo microscopio óptico.
1.2.4.2 Microscopía electrónica de barrido para identificar el crecimiento de células epiteliales amnióticas en estructuras musculares descelularizadas. Tome células epiteliales amnióticas humanas en buen crecimiento. Cuando el 80% de las células estén cerca de la fusión, digírelas utilizando el. Se sembraron células epiteliales amnióticas en estructuras musculares descelularizadas, se colocaron en una placa de 24 pocillos, se cultivaron en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, 5 % de CO2 y humedad saturada durante 7 días, se fijaron con glutaraldehído al 2 % y se realizó un gradiente. Deshidratado con etanol, secado con CO2 punto crítico, recubierto, observado y fotografiado mediante microscopio electrónico de barrido.
2 Resultados
2.1 Estructura del tejido y componentes del armazón La apariencia del músculo descelularizado era de color blanco lechoso, translúcido y de textura suave. En términos generales, no hubo cambios significativos en el tamaño y la forma generales del músculo antes y después de la descelularización. La observación de la tinción HE de la sección longitudinal del andamio mostró que los componentes de las células del músculo esquelético desaparecieron, mientras que la estructura de la rejilla de fibras permaneció intacta y el andamio estaba compuesto principalmente por canales paralelos. La tinción con VG+ET demostró que los componentes del andamio eran principalmente componentes de la matriz extracelular, como fibras de colágeno y fibras elásticas. Las fibras de colágeno eran estructuras onduladas de color rojo y las fibras elásticas eran estructuras filamentosas azules, como se muestra en la Figura 1.
2.2 La compatibilidad de las células epiteliales de la membrana amniótica y los armazones musculares descelularizados se muestra en la Figura 2. La tinción con HE muestra que las células epiteliales de la membrana amniótica humana crecen bien y se distribuyen uniformemente en el armazón (Figura
<) p> Figura 1 Go Macro y tinción de la sección de tejido de armazones de músculo celularFigura 2 Imágenes patológicas de armazones de músculo descelularizado 2A). La tinción inmunohistoquímica mostró una gran cantidad de células BrdU positivas, lo que indica que las células epiteliales amnióticas humanas en el andamio tienen la capacidad de proliferar (Figura 2B). La tinción con anti-NT3 y BDNF mostró que las células epiteliales amnióticas humanas en el andamio contenían gránulos positivos para NT3 y BDNF, que eran marrones y estaban distribuidos en el citoplasma (Figura 2C, 2D). El microscopio electrónico de barrido JSM5600LV mostró que había una gran cantidad de células distribuidas dentro del andamio. Las células estaban distribuidas de manera relativamente uniforme en el andamio y estaban en buen estado de crecimiento (Figura 2E).
3 Discusión
El material de soporte ideal debe ser similar a la matriz extracelular y tener buena biocompatibilidad con las células vivas [7, 8].
Como material de soporte de bioingeniería para el tratamiento de lesiones nerviosas, el músculo descelularizado tiene las siguientes ventajas: (1) Los componentes de la matriz extracelular del músculo descelularizado desempeñan un papel importante en la migración, la adhesión, el crecimiento y el metabolismo de las células del tejido. Los axones regenerados pueden Se adhiere bien a las estructuras musculares descelularizadas [9]. (2) La estructura de disposición de los músculos descelularizados es similar a la de los tubos neuronales, sólo que su diámetro es ligeramente mayor que el de los tubos neuronales [10]. Proporcionan suficiente espacio para que crezcan los axones [9]. La regeneración repentina es muy importante. Fansa et al. compararon los resultados de diferentes biomateriales descelularizados (músculo, vena, epineuro) inoculados con células de Schwann para unir nervios periféricos defectuosos y encontraron que los andamios musculares descelularizados (andamios de venas y epineuro) carecían de estructuras similares a tubos neurales) y estaban desordenados. ordenados desordenadamente, mientras que los axones regenerados en andamios musculares descelularizados con estructuras en forma de tubos neuronales están dispuestos de manera ordenada [11]. Este orden de la regeneración axonal también es muy importante para la regeneración axonal después de una lesión nerviosa. (3) La reacción de rechazo inmunológico causada por el músculo descelularizado es menor [9, 12]. Estas ventajas sugieren que el músculo descelularizado puede ser un material ideal para el tratamiento de lesiones nerviosas. El método utilizado en este estudio para crear músculos descelularizados se utiliza principalmente para reducir el rechazo inmunológico de los materiales de xenoinjerto. Este método puede eliminar eficazmente las membranas lipídicas, los antígenos asociados a las membranas y las proteínas solubles, y puede conservar eficazmente la estructura espacial original de los componentes de la matriz extracelular. Las células musculares normalmente se distribuyen en paralelo, y sus componentes de la matriz extracelular también se distribuyen en paralelo. A partir de los resultados de la sección longitudinal del armazón, se puede ver que los componentes de fibra del armazón también están dispuestos en paralelo. Los resultados de la tinción ET muestran que los componentes principales de la matriz extracelular son las fibras de colágeno y la elasticidad de las fibras permanece intacta. Estos resultados confirman además que este método puede preparar con éxito estructuras musculares descelularizadas.
Dado que el efecto del uso exclusivo de estructuras musculares descelularizadas para tratar enfermedades neurológicas es limitado [13], también es necesario verificar la biocompatibilidad del músculo descelularizado. En este estudio, se utilizaron células epiteliales amnióticas humanas como células semilla para sembrar estructuras musculares acelulares para explorar su compatibilidad. Los estudios han demostrado que las células epiteliales de la membrana amniótica contienen una variedad de factores biológicamente activos, que incluyen mucina, factor de crecimiento de transferencia, prostaglandina E, sustancias similares al factor de crecimiento epidérmico, IL1, IL8 y otros factores. Además, también pueden secretar importantes factores neuronales. como BDNF y NT3 factores nutricionales [4]. Entre ellos, los factores bioactivos como la laminina, BDNF y NT3 juegan un papel muy importante en el tratamiento de la lesión nerviosa. Las células epiteliales de la membrana amniótica se pueden utilizar como células semilla ideales y, combinadas con estructuras musculares descelularizadas, pueden convertirse en un material de ingeniería de tejidos ideal para el tratamiento de enfermedades neurológicas. Este experimento observó que las células epiteliales de la membrana amniótica humana estaban distribuidas uniformemente en la estructura del músculo descelularizado. La inmunohistoquímica anti-BrdU, BDNF y NT3 mostró que las células epiteliales de la membrana amniótica en la estructura del músculo descelularizado tenían una buena capacidad de proliferación y podían expresar BDNF y NT3, lo que indica. que las células epiteliales de la membrana amniótica mantuvieron una buena actividad biológica en estructuras musculares descelularizadas. Los resultados anteriores, por un lado, demuestran que la estructura muscular descelularizada producida en este estudio tiene buena biocompatibilidad y, por otro lado, proporcionan una base teórica y experimental para el uso combinado de células epiteliales amnióticas y estructuras musculares descelularizadas para tratar enfermedades neurológicas.
En resumen, este estudio preparó con éxito un andamio muscular acelular y confirmó que las células epiteliales amnióticas humanas pueden secretar factores neurotróficos importantes en el andamio muscular descelularizado y el andamio muscular descelularizado proporciona diversos beneficios. factores como la membrana basal y los factores neurotróficos para la regeneración de defectos nerviosos, formando un buen microambiente de regeneración nerviosa, que favorece una mejor reparación de los defectos nerviosos. Proporciona más investigaciones sobre el cuerpo puente de las células epiteliales de la membrana amniótica y los andamios musculares descelularizados. El daño a los nervios ha sentado una cierta base experimental.
Referencias
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