El método de extracción de plásmidos por lisis alcalina es el siguiente:
1 Principio experimental:
Los plásmidos extraídos por lisis alcalina se basan en el **. *Plásmido circular cerrado de valencia. Las diferencias topológicas entre el ADN y el ADN cromosómico lineal los separan. En el estrecho rango de pH entre 12,0 y 12,5, la estructura lineal de doble hélice del ADN se desenrolla y se desnaturaliza. Aunque en tales condiciones se rompen los enlaces de hidrógeno del ADN plasmídico de bucle cerrado altamente valente, las dos hebras complementarias se enrollan. uno alrededor del otro y permanecen estrechamente unidos.
Cuando se añade el tampón alto en sal de acetato de potasio de pH 4,8 para restaurar el pH a neutro, las dos hebras complementarias del ADN plasmídico circular cerrado altamente valente permanecen juntas, por lo que la renaturalización es rápida y precisa, mientras Las dos hebras complementarias de ADN cromosómico lineal se han separado completamente entre sí, la renaturalización no será tan rápida y precisa. Se entrelazan para formar una estructura de red mediante centrifugación, ADN cromosómico y ARN de macromolécula inestable, complejos de proteína-SDS, etc. precipitan juntos y se eliminan.
2. Pasos de la operación:
1. Preparar tubos de cultivo esterilizados de 20ml, numerarlos, agregar 8ml de medio de cultivo LB y luego agregar 8l de los antibióticos correspondientes. agregue más según corresponda ;
2. Utilice una punta de pipeta blanca de 10 l para recoger una sola colonia en un tubo de cultivo, agite a 37 °C durante la noche (274 rpm);
3. Tome 2 ml de cultivo nocturno. Agregue el líquido bacteriano al tubo de centrífuga, centrifugue a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante (repita el paso 2 hasta que se centrifuge el líquido bacteriano) (use papel para absorber el sobrenadante; )
4. Agregue 250 µl de tampón P1 (que contiene RNasa A) al tubo de centrífuga donde se precipitaron las células bacterianas, mezcle bien con una pipeta y suspenda las células bacterianas;
>5. Agregue 250 µl al tubo de centrífuga P2, mezcle suavemente hacia arriba y hacia abajo de 4 a 6 veces para obtener un lisado claro (la mezcla violenta cortará el ADN cromosómico y reducirá la pureza del plásmido);
6. Agregue 350 µl de Tampón N3, mezcle inmediatamente invirtiendo hacia arriba y hacia abajo de 4 a 6 veces. En este momento, aparecerá un precipitado floculento. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente;
7. Transfiera con cuidado el sobrenadante obtenido en el paso 6 a una columna de absorción limpia. Asegúrese de que no se aspiren gránulos ni restos celulares. Centrifugar a 10.000 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente hasta que el lisado pase completamente por la columna de absorción y desechar el líquido residual en el tubo de recogida;
8. Añadir 150 µl de Buffer PB a la columna de adsorción. centrifugar a 10.000 rpm durante 1 minuto y desechar el tubo de recogida.
9. Añadir 400 µl de Buffer PW a la columna de adsorción (verificar si se añade etanol absoluto), centrifugar a 10.000 rpm durante 1 minuto. y vierta el líquido residual en el tubo de recogida. Vacíe nuevamente durante 2 minutos (puede calentar el tampón EB a 65 ~ 70 ℃ en este momento);
10. Coloque la columna de adsorción en un tubo de centrífuga nuevo, abra la tapa y sople aire durante aproximadamente 4. minutos (asegúrese de eliminar el etanol, el etanol afectará los siguientes pasos);
11. Agregue 90 µl de tampón EB a la parte media de la membrana de adsorción de la columna de adsorción (el número de copias de pET). La serie es baja, simplemente agregue 70 μl de EB) y déjela reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos. Centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min;
12. Verter el líquido nuevamente en la columna de adsorción y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min.
13. , márcalo, abre la tapa y déjalo a temperatura ambiente unas dos horas. Almacene los plásmidos a -40°C.