Métodos para diseñar cebadores degenerados
Los cebadores degenerados se refieren a una mezcla de diferentes secuencias de bases utilizadas para codificar una secuencia peptídica corta. Se utiliza principalmente como método para la clonación homóloga de genes desconocidos o para analizar el polimorfismo de un determinado gen. Los procedimientos comunes para el diseño de cebadores degenerados son los siguientes: 1. Utilice NCBI para buscar la secuencia de aminoácidos codificada por la proteína o el ADNc del mismo gen diana en diferentes especies.
Debido a la relación de codones, diferentes secuencias de ácidos nucleicos pueden expresar la misma secuencia de aminoácidos, por lo que la secuencia de aminoácidos está realmente conservada. Primero, utilice el sistema de búsqueda Entrez del NCBI para encontrar una secuencia relevante. Luego, esta secuencia se usó para buscar secuencias de aminoácidos similares en toda la base de datos Nr usando BLASTp (Protein by Protein).
2. Realizar alineación de secuencias múltiples en las secuencias encontradas.
Para realizar múltiples comparaciones de secuencias de diferentes secuencias de aminoácidos del mismo gen buscado, lo mejor es utilizar un programa de alineación local como BLOCK, URL: /thread-8194-1-1.html.
5. Modificación de cebadores
Si el cebador obtenido es: 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3, entonces su degeneración = 4×2×4×3×4×3× 2=2304. , es obvio que la degeneración de este cebador es demasiado alta y no favorece la PCR. Podemos reducir la degeneración usando hipoxantina en lugar de N (porque la hipoxantina puede combinarse bien con 4 tipos de bases) y según la preferencia de codones de la especie (hay un sitio web de base de datos para verificar la preferencia de codones:/viewthrea... ht=C3DCC2EBD7 D3).
Nota: Este método diseña pares de cebadores degenerados, que son adecuados para especies a las que pertenecen las secuencias de aminoácidos utilizadas para la comparación y otras especies con el mismo estado taxonómico que estas especies.
Explicación de los símbolos en las cartillas:
A significa A
C significa C
G significa G
T significa T
M significa A o C
R significa A o G
W significa A o T
S significa C o G
Y significa C o T
K significa G o T
V significa A o C o G
H significa A o C o T
D significa A o G o T
B significa C o G o T
N significa G o A o T o C