Principio de precipitación gradual de sulfato de amonio Principio y plan experimental de precipitación gradual de sulfato de amonio

1. Principios básicos

El método de precipitación con sulfato de amonio se puede utilizar para concentrar y purificar parcialmente proteínas a partir de grandes cantidades de preparados crudos. Este método puede separar los principales glóbulos inmunes de la muestra y es un método común para el aislamiento de inmunoglobulinas. Las altas concentraciones de iones salinos en soluciones de proteínas pueden competir con las proteínas por las moléculas de agua, destruyendo así la película de hidratación en la superficie de la proteína, reduciendo su solubilidad y provocando que precipite de la solución. Varias proteínas tienen diferentes solubilidades, por lo que se pueden usar soluciones salinas de diferentes concentraciones para precipitar diferentes proteínas. Este método se llama salazón. La concentración de sal generalmente se expresa en términos de saturación. El sulfato de amonio es el más utilizado debido a su alta solubilidad, pequeño coeficiente de temperatura y dificultad para desnaturalizar las proteínas.

2. Reactivos e instrumentos

1. Sobrenadante de cultivo de tejidos, muestra de suero o ascitis, etc.

2. Sulfato de amonio (NH 4) SO 4

3. Solución saturada de sulfato de amonio (SAS)

4. Agua destilada

5. PBS (que contiene 0,2 g/l de azida sódica)

6. Bolsa de diálisis

7. Ultracentrífuga

8. Medidor de pH

9. Agitador magnético

Tres pasos de operación

Tome ascitis o sobrenadante de cultivo de tejidos como ejemplo para introducir la precipitación de anticuerpos con sulfato de amonio. El grado de saturación de sulfato de amonio necesario para la salazón de diversas inmunoglobulinas tampoco es exactamente el mismo. La saturación de sulfato de amonio que se utiliza habitualmente para aislar anticuerpos es del 33% al 50%.

(1) Preparación de solución saturada de sulfato de amonio (SAS)

1. Añadir lentamente 767 g (NH 4 ) 2 SO 4 a 1 litro de agua destilada mientras se agita. Utilice amoníaco o ácido sulfúrico para ajustar el pH del ácido sulfúrico a 7,0. Se trata de una solución de sulfato de amonio con una saturación del 100% (4,1 mol/L, 25 °C).

2. Preparación de otras soluciones de amonio con diferentes saturaciones

(2) Precipitación

1. Centrifugar la muestra (como la ascitis) a 20 000 ′ g durante 30 minutos para eliminar los restos celulares

2. Conservar el sobrenadante y medir el volumen

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3. Agregar lentamente un volumen igual de SAS al sobrenadante mientras se agita, con una concentración final de 1:1 (

4. Colocar la solución en un agitador magnético y agitar durante 6 horas o durante la noche (4°C) para precipitar completamente la proteína.

(3) Diálisis

1. Centrifugar la solución de proteína a 10 000 ′ g durante 30 min (4°C). y deseche el sobrenadante

2. Disuelva el precipitado en una pequeña cantidad (10-20 ml) de PBS -0,2 g/L de azida sódica. Después de disolver el precipitado, colóquelo en la bolsa de diálisis. /p>

PBS -0,2g/L Dializar L azida sódica durante 24-48 horas (4°C), y cambiar el tampón de diálisis cada 3-6 horas para eliminar completamente el sulfato de amonio;

3. Centrifugar el dializado y medir el sobrenadante

IV. Consejos de aplicación

(1) Preprecipitar con una concentración menor de sulfato de amonio para eliminar las impurezas de la muestra

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1. Agregue lentamente SAS a la solución de muestra mientras agita para obtener una concentración de 0,5:1 (v/v).

2. Coloque la solución en un agitador magnético y agite durante 6 horas; o durante la noche (4 °C); centrifugar a 3,3000′ g durante 30 min (4 °C), retener el sobrenadante; agregar SAS al sobrenadante a 0,5:1 (v/v) y centrifugar; nuevamente para obtener el precipitado. Disolver el precipitado en PBS y dializar como antes para eliminar el sulfato de amoníaco;

4. Agregar SAS al sobrenadante a 0,5:1 (v/v) y centrifugar nuevamente para obtener el precipitado. precipitado.

Disolver el precipitado en PBS y dializar como antes para eliminar el sulfato de amoníaco;

5. Cuando la solubilidad de la proteína impureza y la proteína a purificar en la solución de sulfato de amoníaco es muy diferente, es muy eficaz use preprecipitación para eliminar la proteína impureza (2) Para evitar un volumen excesivo, se puede usar sulfato de amonio sólido para la sal (consulte la Tabla 1 para conocer la cantidad de sulfato de amonio); El método de precipitación con sulfato se puede utilizar en combinación con la tecnología de cromatografía para obtener anticuerpos purificados adicionales.

El experimento de hoy consiste en utilizar sulfato de amonio para precipitar proteínas. Por experiencia previa, sabemos que este paso es notoriamente problemático. Es necesario agregar sulfato de amonio lentamente a la solución de proteínas con un grifo.

Los principios relevantes se pueden encontrar en el sitio web de aprendizaje de Zhuang Ronghui. A diferencia de la disolución de sal, agregar sulfato de amonio a una solución de proteína hará que la solubilidad de la proteína disminuya y, por lo tanto, precipite. Debido a que los iones disociados por el sulfato de amonio tienen una gran capacidad y transportan una gran cantidad de electrones (NH4+, SO42-), cuando se disuelve en agua atraerá una gran cantidad de moléculas de agua para hidratar estos iones.

Hay algunas áreas menos polares en la superficie de las moléculas de proteína. Las moléculas de agua se reunirán en la superficie de estas áreas no polares para formar una estructura similar a una "jaula de agua" (ver la imagen a continuación). , para que la proteína se disuelva en agua. Una vez que se agrega sulfato de amonio a la solución de proteína, esta última atrae una gran cantidad de moléculas de agua, lo que hace que la jaula de agua no pueda aislar eficazmente las regiones no polares de la proteína, lo que provoca atracción entre estas regiones no polares y, por lo tanto, precipitación. Por lo tanto, cuantas más áreas no polares haya en la superficie de una molécula, más fácil será precipitar con sulfato de amonio. En términos de calcular el peso del sulfato de amonio agregado, encontré un buen sitio web: Calculadora de sulfato de amonio

En esta página, puede ingresar la temperatura experimental, el volumen de la solución, la concentración porcentual deseada y el uso de estos cuatro valores. De la concentración porcentual inicial, se pueden obtener los gramos de sulfato de amonio que se deben agregar, así como el aumento de volumen después de agregar sulfato de amonio sólido. Es un muy buen sitio web.

Otra cosa que vale la pena mencionar es que agrego sulfato de amonio de dos maneras. La primera es moldear el sulfato de amonio sólido en pedazos y la otra es disolver el sulfato de amonio en una solución saturada y luego agregarlo. , cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas, la comparación es la siguiente:

1. El grado de deterioro de las proteínas: sulfato de amonio sólido > solución saturada de sulfato de amonio

El uso de saturados. La solución de sulfato de amonio es realmente excelente. Es una barra y se puede gotear muy rápidamente sin causar deterioro (aún no he probado a verterla). A diferencia del sulfato de amonio sólido, solo puedes molerlo y agregarlo lentamente. Si la velocidad es demasiado rápida, la proteína se romperá (la solución producirá densas burbujas blancas).

2. Facilidad de operación: solución saturada de sulfato de amonio >> sulfato de amonio sólido

La mayor desventaja del sulfato de amonio sólido es que no es fácil de operar. y no demasiado rápido, por lo que este es un paso agotador cuando tienes mucha proteína para disolver. Sin embargo, la solución saturada de sulfato de amonio es más problemática solo en la parte de preparación. Primero debe calentarse para saturarla, luego volver a la temperatura de funcionamiento para sobresaturarla y finalmente los cristales de sulfato de amonio se eliminan con papel de filtro.

3. Amplificación de volumen de la solución de proteína Solución saturada de sulfato de amonio>>Sulfato de amonio sólido

Esta es la parte más problemática del uso de una solución saturada de sulfato de amonio, por ejemplo, para hacer el porcentaje. de sulfato de amonio en 100 ml varía de 0% a 25%. Si se agrega sulfato de amonio sólido, la solución solo cambiará de 100 ml a aproximadamente 107 ml, pero si se agrega una solución saturada de sulfato de amonio, la solución será de 125 ml. ! Y si quieres aumentarlo al 50%, debes agregar una cantidad igual de solución saturada de sulfato de amonio, así la solución de proteína cambiará de 100 ml a 200 ml.

Por lo tanto, al añadir sulfato de amonio, si la concentración es baja, se puede utilizar una solución saturada de sulfato de amonio, pero si la concentración es alta, a menos que no te importe la amplificación del volumen. de la solución de proteína (de todos modos debe centrifugarse), en caso contrario es mejor utilizar sulfato de amonio sólido.