La ubiquitina es una pequeña proteína que contiene 76 aminoácidos y un tamaño aproximado de 8,6 kDa. Es ubicua y está muy conservada en eucariotas. Cuatro genes del genoma humano codifican la ubiquitina: UBB, UBC, UBA52 y RPS27A.
La ubiquitina tiene 7 residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) y un residuo de metionina (M1). Diversas conexiones entre ubiquitinas se establecen principalmente a través de residuos de lisina y residuos de metionina. Las cadenas de ubiquitina resultantes producen una determinada topología que modifica el sustrato proteico y determina su función.
La adición de ubiquitina a una proteína sustrato se denomina ubiquitinación de la proteína. La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional dinámica y multifacética involucrada en casi todos los aspectos de la biología eucariota. La ubiquitinación implica tres pasos principales: activación, conjugación y ligación, realizados por enzimas activadoras de ubiquitina (E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2) y ubiquitina ligasas (E3), respectivamente. Entre ellos, hay dos tipos de E1 humano: UBA1 y UBA6; hay 35 tipos de E2 humano y hay cientos de tipos de E3 humano.
Las enzimas E3 tienen uno de dos dominios: el dominio HECT y el dominio RING. La ligasa E3 del dominio HECT primero se une a la ubiquitina y luego la transfiere al sustrato, mientras que la ligasa E3 del dominio RING permite que la enzima E2 transfiera directamente la ubiquitina al sustrato.
El dominio E3 de HECT conecta los sustratos diana de la ubiquitina a través de 2 mecanismos: primero, la ubiquitina se transfiere desde el sitio activo de E2 a Cys en el sitio activo de E3, y luego la ubiquitinación a residuos de Lys en el sustrato diana. Por el contrario, las ligasas E3 de dominio RING y relacionadas con RING sirven como andamios para la ubiquitinación de sustratos diana en un solo paso: E2 transfiere ubiquitina directamente a los residuos de Lys en el sustrato diana.
Actualmente, la enzima E4 todavía existe en el cuerpo humano. La enzima E4 es un factor de elongación de la cadena de ubiquitina que puede extender la cadena de ubiquitina de sustratos monoubiquitinados para formar poliubiquitinación.
La monoubiquitinación es la adición de una molécula de ubiquitina a un residuo proteico del sustrato. La polimonoubiquitinación es la adición de una molécula de ubiquitina a múltiples residuos de sustrato. La poliubiquitinación es la formación de cadenas de ubiquitina en residuos individuales de una proteína sustrato. Actualmente, los residuos de sustrato a los que se puede unir la ubiquitina incluyen lisina, serina, cisteína y tirosina. Según el sitio de conexión entre la ubiquitina y el sustrato, actualmente existen 9 formas de unirse a la ubiquitina, incluida la imprimación M1. , K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, G76. Diferentes modos de ubiquitinación regulan diferentes funciones. Entre ellos, la ubiquitinación relacionada con la degradación proteasomal es K48.
Estudios proteómicos exhaustivos han identificado miles de sitios de ubiquitinación en decenas de miles de proteínas. La mayoría de las proteínas sufrirán ubiquitinación en algún momento durante su vida celular.
El estudio de la degradación de la proteína ubiquitina-proteosoma consiste principalmente en estudiar la relación entre dos proteínas, concretamente una ligasa E3 y una proteína sustrato.
La cicloheximida (CHX) es un inhibidor de la síntesis de proteínas intracelulares. MG132 es un inhibidor del proteasoma.
En la Figura 3, en comparación con la proteína SUSTRATO en el grupo no tratado con MG132, que no tuvo cambios significativos en cada momento, los niveles de proteína SUSTRATO en el grupo tratado con MG132 se redujeron significativamente a las 2 h, 4 h y 8h. Muestra que la degradación del SUSTRATO está relacionada con el proteosoma.
En la Figura 4, a medida que aumenta el nivel de expresión de la ubiquitina ligasa E3, el nivel de expresión de la proteína sustrato disminuye en consecuencia. En la Figura 5, a medida que aumenta el nivel de expresión de la mutación que inactiva la ubiquitina ligasa E3, el nivel de expresión de la proteína sustrato no cambia significativamente. En la Figura 6, se usó ARNip de ubiquitina ligasa E3 para reducir el nivel de expresión de ubiquitina ligasa E3 en las células, y el nivel de expresión de la proteína sustrato aumentó en consecuencia. En la Figura 7, la sobreexpresión de la enzima ubiquitina ligasa E3 reduce la vida media de la proteína sustrato. En la Figura 8, la eliminación de la enzima ubiquitina ligasa E3 aumentó la vida media de la proteína sustrato. Esto muestra que la ubiquitina ligasa E3 puede reducir el nivel de expresión de las proteínas sustrato.
Utiliza la inmunoprecipitación para detectar la interacción entre dos proteínas. Se dividen a grandes rasgos en los siguientes tres tipos:
Analizar los diferentes dominios de la ubiquitina ligasa E3 y las proteínas sustrato a través de la literatura o la bioinformática. La parte superior de la Figura 15 es un diagrama esquemático de los diferentes dominios de la ubiquitina ligasa E3: Dominio1, Dominio2, Dominio3 y Dominio4; la parte inferior de la Figura 15 es un diagrama esquemático de los diferentes dominios de la proteína sustrato: DominioA, DominioB; , DominioC y DominioD. Utilice el método de inmunoprecipitación para detectar la interacción entre diferentes dominios de dos proteínas, consulte la Figura 16 y la Figura 17. Después de encontrar el dominio correspondiente, detecte la interacción entre los dos dominios, consulte la Figura 18 y la Figura 19.
Generalmente, para detectar la ubiquitinación de proteínas se utilizan moléculas de ubiquitina expresadas exógenamente, y también se pueden utilizar anticuerpos de ubiquitina endógena. Debido a que la ubiquitinación es la unión valerosa de las moléculas de ubiquitina a las proteínas sustrato, el SDS no puede destruir esta interacción, por lo que la presencia de cadenas de poliubiquitinación se puede observar en la Figura 20. Una molécula de ubiquitina pesa aproximadamente 8,5 KD, por lo que los resultados de IB pueden aparecer como una banda de escalera clara o una banda de frotis basada en la proteína sustrato.
La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional de proteínas que puede regular la función proteica.
Los tipos de ubiquitinación actuales incluyen K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63, es decir, K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63 de la molécula de ubiquitina están unidos de manera valente a la proteína sustrato. En general, se cree que el proteosoma puede reconocer la ubiquitinación de K48. Por tanto, es necesario confirmar que la cadena de ubiquitina de la proteína sustrato es una cadena K48. Mute un solo punto de lisina en la molécula de ubiquitina (consulte la Figura 21) o mute un solo punto de lisina en la molécula de ubiquitina (consulte la Figura 23) y detecte el tipo de ubiquitinación de la proteína sustrato mediante métodos de inmunoprecipitación e inmunotransferencia, consulte la Figura 22 y la Figura 24.
Detecta cambios en los niveles de ubiquitinación de proteínas sustrato sobreexpresando (Figura 25) o derribando (Figura 26) la ubiquitina ligasa E3.
La ubiquitinación in vitro puede excluir el entorno complejo del cuerpo, lo que permite que la ubiquitina ligasa E3 interactúe directamente con las proteínas del sustrato, lo que hace que la ubiquitinación de las proteínas del sustrato por parte de la ubiquitina ligasa E3 sea más convincente. Hay kits comerciales disponibles para UB, E1, E2, ATP y tampón in vitro. Simplemente purifique la ubiquitina ligasa E3 y la proteína sustrato para la reacción de ubiquitina in vitro para detectar la ubiquitinación de la proteína sustrato.