Por ello, el estudio de las interacciones proteicas se ha convertido en uno de los aspectos más importantes en el estudio de las funciones y mecanismos de las proteínas.
Además, la esencia de la interacción de proteínas son en realidad tres tipos de fuerzas, enlaces de hidrógeno, fuerzas intermoleculares (fuerzas de van der Waals) y fuerzas hidrofóbicas. Como estas tres fuerzas actúan en distancias cortas, normalmente suponemos que las proteínas que interactúan deben estar cerca una de otra. Aunque ésta es una proposición suficiente e innecesaria, a menudo utilizamos lo contrario de esta proposición para pruebas experimentales.
Entonces, ¿cómo estudiar este problema? Aquí, Brother Dog lo llevará a comprender los métodos de investigación comunes de las interacciones de las proteínas.
Figura 1
A
La levadura bihíbrida (Y2H) es una tecnología antigua. Stanley Fields y Ok-KyuSong desarrollaron este método para detectar interacciones proteína-proteína utilizando los principios del operón de lactosa GAL4 en E. coli 1989.
El operón GAL4 tiene dos dominios, BD (dominio de unión) y AD (dominio de activación). El dominio BD puede unirse a la región de ADN UAS (secuencia activadora aguas arriba) y el dominio AD puede activar la expresión génica. aguas abajo del UAS.
Por lo tanto, cortaron los dos dominios de GAL4 para que BD pueda unirse a la proteína diana y unirse primero a la región UAS aguas arriba del gen informador lacZ. Luego, la proteína cuya interacción con la proteína objetivo debe analizarse se fusiona con el dominio AD y se expresa. Si la proteína objetivo y la proteína que se detecta pueden interactuar, deben estar espacialmente cerca una de otra.
Esta interacción puede acercar espacialmente los dominios AD y BD entre sí, activando así la expresión del gen indicador lacZ, haciéndolo detectable, como se muestra en la Figura 1.
Las ventajas de este método son su bajo coste y su sencillo funcionamiento. Este método alguna vez fue muy popular y puede usarse para detectar proteínas que interactúan de genes objetivo, verificar interacciones y detectar cuantitativamente la fuerza de las interacciones.
Pero la desventaja es que todas las proteínas analizadas necesitan formar proteínas de fusión con dominios AD/BD, y la conformación espacial puede cambiar. En segundo lugar, muchas interacciones de proteínas pueden requerir la ayuda de otras proteínas al mismo tiempo, y este sistema no puede extraer estas proteínas auxiliares para la detección, por lo que a menudo se pasan por alto muchas interacciones de proteínas. En tercer lugar, porque la reacción se produce en las células de los hongos.
Si la proteína objetivo es de otra especie, es posible que este experimento no refleje el verdadero estado de la proteína en las células de la especie original. Finalmente, algunas proteínas pueden activar la expresión de genes indicadores, como los factores de transcripción, lo que hace que dichas proteínas no puedan ser analizadas y verificadas por dos híbridos de levadura (por supuesto, las proteínas también se pueden transferir a vectores AD, pero aún así tienen sus limitaciones).
II
Co-localización de fluorescencia; en el pasado, esta técnica se usaba generalmente para demostrar interacciones de proteínas en las células. Hace unos años, si se tratara de proteínas de otras especies, se utilizaría un sistema de dos híbridos de levadura para verificar sus interacciones. El revisor puede decir que el suyo no refleja la verdadera situación de la especie original y puede ser un falso positivo.
En este momento, algunos investigadores fusionaron estas dos proteínas con proteínas fluorescentes de diferentes colores y las expresaron en las células de la especie original. Bajo un microscopio de alta resolución, si dos luces fluorescentes aparecen en el mismo lugar, se demuestra que están cerca en el espacio y es probable que interactúen. Sin embargo, como se mencionó en la oración anterior, es solo una posibilidad y no puede usarse como evidencia directa para demostrar que realmente interactuaron. Esta técnica se utiliza generalmente cuando no queda otra, por lo que no pondré ningún ejemplo.
Tres
La tecnología de complementación de fluorescencia bimolecular (BIFC) divide la proteína verde fluorescente GFP en dos segmentos y los fusiona con dos proteínas que se van a probar respectivamente.
Si dos proteínas interactúan, los dos fragmentos de GFP pueden estar espacialmente cerca uno del otro y eventualmente pueden emitir fluorescencia verde bajo excitación láser, como se muestra en la Figura 2.
La GFP aquí también puede ser reemplazada por luciferasa de luciérnaga. El principio es el mismo, excepto que la luciferasa necesita un sustrato y emite autofluorescencia en lugar de luz de excitación. La ventaja de esta tecnología es que se puede observar en células vivas y se puede utilizar para monitoreo en tiempo real y experimentos cuantitativos.
Sin embargo, la resolución espacial de esta tecnología es de alrededor de 250 nm, lo que todavía es una distancia larga para las interacciones de proteínas, por lo que es probable que sea un falso positivo, y la proteína de fusión también puede afectar la conformación espacial de la proteína que se está analizando, lo que genera resultados falsos positivos y falsos negativos. En general, esta técnica es mejor que las dos primeras.
Figura 2
Cuatro
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), esta tecnología es diferente a la tercera.
Las personas fusionaron y expresaron la proteína A diana con la proteína fluorescente cian CFP, y la posible proteína B de A que interactúa con la proteína fluorescente amarilla YFP. La luz de excitación de la CFP es luz ultravioleta con una longitud de onda de 414 nm, mientras que la longitud de onda de fluorescencia es luz azul con una longitud de onda de 475 nm, que resulta ser luz azul de alrededor de 475 nm y luz amarilla de alrededor de 525 nm. Si dos proteínas AB interactúan.
Cuando la CFP solo se excita con luz ultravioleta, la luz azul emitida por la CFP será absorbida directamente por YFP, emitiendo así luz amarilla, como se muestra en la Figura 3. Si podemos cuantificar los cambios en la eficiencia de la luz amarilla de la CFP, entonces podemos detectar cambios en la distancia entre las dos proteínas.
Por lo tanto, esta tecnología no solo puede verificar las interacciones de las proteínas, sino también caracterizar cambios dinámicos en las distancias de interacción, como la dirección y la velocidad del movimiento relativo directo de las moléculas de proteínas. Por ejemplo, en este artículo, los autores utilizan FRET para medir el estrés en las células durante el movimiento.
Figura 3
V
Co-inmunoprecipitación (co-IP), el principio de esta tecnología es utilizar la afinidad del antígeno y el anticuerpo para verificar la relación entre proteínas. interacciones entre.
La gente usa partículas grandes de agarosa o perlas magnéticas para reticular anticuerpos o afinidad, y luego usa estas partículas grandes con anticuerpos para identificar proteínas objetivo en la solución. En este punto, si la proteína objetivo ha interactuado con otras proteínas para formar un complejo, el complejo proteico que contiene la proteína objetivo se verá afectado por la afinidad de estas partículas grandes porque el anticuerpo está anclado en estas partículas grandes.
Se pueden eliminar las partículas no específicamente unidas lavándolas con varios tampones y recogiéndolas mediante centrifugación o aspiración con rejilla magnética. En este punto, las proteínas unidas a estas partículas son teóricamente proteínas que pueden interactuar directa o indirectamente con la proteína objetivo.
A menudo has adivinado las posibles proteínas que interactúan antes de realizar el experimento, por lo que puedes ejecutar los complejos de proteínas que están abrumados por partículas grandes en SDS-PAGE.
Luego, se puede utilizar el método de transferencia Western para detectar los anticuerpos de estas proteínas potencialmente interactuantes, y se puede verificar la interacción entre las proteínas, como se muestra en la Figura 4. Dependiendo del propósito del experimento, el método de inmunoprecipitación puede modificarse de muchas maneras.
Por ejemplo, si quieres verificar la interacción directa entre proteínas, puedes elegir un sistema de traducción in vitro para sintetizar un par de proteínas que deben verificarse en un tubo de ensayo, y luego mezclarlas e incubarlas. ellos para su detección. Este par de proteínas también se puede purificar mediante un sistema de expresión procariota y luego mezclar e incubar para su detección. El método de inmunoprecipitación es razonable, se pueden realizar muchos experimentos interesantes y se pueden responder muchas preguntas.
Figura 4
VI Las proteínas que interactúan pueden detectarse mediante Western-blot.
Pero ¿qué pasa si quieres encontrar nuevas proteínas interactuantes que no se hayan reportado antes y que no puedas adivinar por ti mismo? En este momento, puede enviar la muestra obtenida después de la inmunoprecipitación al laboratorio para su análisis por espectrometría de masas proteómica e identificar todos los miembros de este complejo mediante espectrometría de masas. En teoría, puede obtener la información de los miembros de todo el complejo de proteínas objetivo, como. como se muestra en la Figura 4.
Si en los experimentos anteriores se usaban armas de fuego para apuntar a los enemigos en la montaña opuesta, entonces el método de espectrometría de masas consiste en usar armas de fuego para eliminar a los enemigos en la montaña opuesta. Existen muchas variaciones del método AP-MS.
Por ejemplo, mediante el uso de algunas enzimas que pueden marcar proteínas periféricas con biotina, podemos fusionar la proteína objetivo con estas enzimas. Luego, dentro de la célula, estas proteínas de fusión se pueden marcar con avidina para marcar todas las proteínas cercanas a la proteína objetivo y luego, mediante la superafinidad de la biotina y la avidina, se puede mejorar enormemente la sensibilidad de la identificación AP-MS. No tenemos que preocuparnos por perder interacciones débiles al lavar enlaces no específicos. Este método se llama etiquetado de proximidad.
Gou Ge nos ayudó a identificar los métodos principales para estudiar las interacciones de las proteínas. Mi tutor ya no se preocupará por mi tema. Sin embargo, el diseño experimental aún debe ser riguroso, controlable, repetible e intercambiable entre presas, etc. Todo esto debe discutirse y considerarse cuidadosamente antes de realizar el experimento.
Por último, los métodos actuales de investigación proteómica de proteínas no sólo son potentes, sino también eficientes y rápidos. Si está interesado en los métodos proteómicos de las proteínas, el hermano Gou puede publicar más artículos y discutirlos con usted uno por uno.
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