Para explorar los mecanismos moleculares de los procesos biológicos es necesario identificar las interacciones proteína-proteína que median este proceso. Las principales técnicas para estudiar las interacciones proteína-proteína se resumen a continuación:
1. Sistema de dos híbridos de levadura
El sistema de dos híbridos de levadura es un método importante actualmente ampliamente utilizado en proteínas. Método de investigación del interactoma. El principio es que cuando la proteína diana y la proteína cebo se combinan específicamente, la proteína cebo se une al promotor del gen indicador e inicia la expresión del gen indicador en células de levadura. Si se detecta el producto de expresión del gen indicador. significa que hay interacción entre los dos, de lo contrario no hay interacción entre los dos. Esta tecnología se puede utilizar para estudiar interacciones de proteínas a gran escala después de microcuantificarlas y ordenarlas. En el trabajo real, la gente ha desarrollado sistemas híbridos únicos, tres sistemas híbridos y sistemas híbridos inversos según las necesidades. Angermayr et al. diseñaron un sistema de dos híbridos mediado por proteínas SOS. Se puede estudiar la función de las proteínas de membrana, enriqueciendo las funciones del sistema de dos híbridos de levadura. Además, el papel del sistema de dos híbridos de levadura también se ha ampliado a la identificación de proteínas.
2. Tecnología de presentación en fagos
La secuencia de ADN de un anticuerpo monoclonal está conectada al gen que codifica la proteína de cubierta del fago. Cuando el fago crece, el anticuerpo monoclonal correspondiente se expresa en el fago. superficie y luego pasa el fago a través de la columna. Si la columna contiene la proteína objetivo, se unirá específicamente al anticuerpo correspondiente. Esto se denomina tecnología de presentación en fagos. Esta tecnología también se utiliza principalmente para estudiar interacciones entre proteínas. No solo es simple y de alto rendimiento, sino que también tiene la capacidad de obtener genes directamente, detectar mezclas complejas con alta selectividad y evaluar directamente interacciones cambiando adecuadamente las condiciones durante la detección. Proceso de especificidad vinculante y otras ventajas. Actualmente, utilizando tecnología de presentación en fagos optimizada, se han mostrado bibliotecas de ADNc de dos líneas celulares especiales de humanos y ratones, y se han aislado moléculas de señalización en la vía de señalización del factor de crecimiento epitelial humano.
3. Tecnología de Resonancia de Plasmón
La tecnología de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) se ha convertido en un nuevo método en el estudio de las interacciones de proteínas. Su principio es utilizar una película a nanoescala para adsorber la "proteína del cebo". Cuando la proteína que se va a probar se une a la proteína del cebo, las propiedades de vibración de la película cambiarán mediante la detección, y se podrá conocer el estado de unión de las dos proteínas. . La ventaja de la tecnología SPR es que no requiere marcadores ni colorantes y el proceso de reacción se puede controlar en tiempo real. El ensayo es rápido y seguro y también se puede utilizar para detectar interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos y otras macromoléculas biológicas.
4. Tecnología de transferencia de energía por fluorescencia
La transferencia de energía por vibración de fluorescencia (FRET) se usa ampliamente para estudiar la distancia entre moléculas y sus interacciones combinada con la microscopía de fluorescencia, se puede usar de manera cuantitativa; Obtener información espaciotemporal sobre proteínas, lípidos, ADN y ARN en organismos vivos. Con el desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP), la microscopía de fluorescencia FRET ha hecho posible medir las propiedades dinámicas de las moléculas dentro de las células vivas en tiempo real. Se propone un método simple para medir cuantitativamente la eficiencia de FRET y la distancia entre el donante y el aceptor. Solo necesita usar un conjunto de filtros y medir una relación, y usar los espectros de emisión del donante y el aceptor para eliminar la interferencia entre ellos. los espectros. Este método es simple y rápido y puede medir cuantitativamente la eficiencia de FRET y la distancia entre el donante y el aceptor en tiempo real, especialmente adecuado para pares donante-aceptor basados en GFP.
5. Tecnología de matrices de anticuerpos y proteínas
La aparición de la tecnología de chips de proteínas ha aportado nuevas ideas a la investigación en proteómica. Uno de los contenidos principales de la investigación proteómica es estudiar los cambios cuantitativos de los niveles de proteínas en diferentes condiciones fisiológicas. El chip de anticuerpos de cuantificación miniaturizado, integrado y de alto rendimiento es una muy buena herramienta de investigación. También es el chip de más rápido desarrollo entre los chips. Y técnicamente se ha vuelto cada vez más maduro. Algunos de estos chips de anticuerpos ya se han desarrollado para aplicaciones clínicas, como los chips de anticuerpos marcadores tumorales, y muchos otros se han aplicado en diversos campos.
6. Tecnología de inmunoinmunoprecipitación La inmunoinmunoprecipitación es una tecnología utilizada principalmente para estudiar las interacciones proteína-proteína. Su principio básico es agregar antiproteína de interés al lisado celular, después de la incubación, agregar proteína A de Staphylococcus aureus. (SPA) que se une específicamente al anticuerpo y se une a las perlas de Pansobin. Si hay una proteína diana que se une a la proteína de interés en la célula, se puede formar un complejo de este tipo: "Proteína diana - proteína de interés - anti. -anticuerpo de proteína de interés - SPA\|Pansobin", debido a que SPA\|Pansobin es relativamente grande, el complejo se separará durante la centrifugación. Después de la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, se separaron los cuatro componentes del complejo. Luego, mediante transferencia Western, se utilizan anticuerpos para detectar cuál es la proteína objetivo y si es una proteína prevista. La proteína objetivo obtenida mediante este método se combina naturalmente con la proteína de interés en las células, lo que es consistente con la situación real del cuerpo, y la proteína obtenida tiene una alta credibilidad. Sin embargo, este método tiene dos defectos: primero, la unión de las dos proteínas puede no ser directa, pero un tercero puede actuar como un puente en el medio; segundo, es necesario predecir cuál es la proteína objetivo antes del experimento; para seleccionar el anticuerpo final a detectar, por lo que si la predicción es incorrecta, el experimento no arrojará resultados y el método en sí es riesgoso.
7. Tecnología pull-down
Hay dos tipos de interacciones proteicas: interacciones firmes e interacciones temporales. Las interacciones robustas son comunes en complejos proteicos de múltiples subunidades y se estudian mejor mediante inmunoprecipitación (Co-IP), tecnología Pull-down o métodos Far-western. La tecnología desplegable utiliza proteínas de cebo etiquetadas e inmovilizadas o proteínas de etiqueta (biotina, PolyHis o GST) para extraer proteínas que interactúan del lisado celular. La tecnología desplegable puede determinar la interacción entre proteínas conocidas y proteínas extraídas o proteínas relacionadas purificadas, y detectar interacciones de proteínas a partir de sistemas de transmisión o traducción in vitro.