Métodos habituales de separación y purificación de proteínas: salting out, salting out, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel, cromatografía líquida de alta resolución.
1. Método de salado: aprovechando las diferencias en la sensibilidad de las diferentes proteínas a la concentración de sal, la proteína se precipita agregando sal gradualmente y luego el precipitado se elimina mediante centrifugación.
2. Método de sal: según la diferencia en el tamaño molecular de la proteína, el tamaño de los poros del medio de filtración en gel se utiliza para separar las moléculas de proteína de la solución.
3. Cromatografía de intercambio iónico: Utilizando la diferencia en la interacción de carga entre la proteína y la matriz de intercambio iónico fijada en la columna, cambiando el valor de pH o la concentración iónica de la solución, la proteína objetivo y la matriz. La interacción produce cambios, logrando así la separación.
4. Cromatografía de afinidad: utilizar la unión específica entre una proteína y un ligando específico (como un anticuerpo, ion metálico, etc.), pasando la solución de proteína mixta a una columna que contiene el ligando en este. En este método, la proteína objetivo se une selectivamente a la columna, luego otras proteínas se eliminan con un tampón y, finalmente, la proteína objetivo se disocia utilizando disolventes con condiciones específicas o cambiando el valor del pH.
5. Electroforesis en gel: basándose en las diferencias de carga, tamaño y forma de las proteínas, se utiliza un campo eléctrico para migrar moléculas de proteínas en un sistema de electroforesis en gel para lograr la separación.
6. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): La separación se logra mediante una columna de cromatografía líquida basada en las diferencias de afinidad de las proteínas en diferentes condiciones de fase móvil.
Es necesario prestar atención a algunas precauciones al realizar la separación y purificación de proteínas.
1. Procesamiento de muestras: el procesamiento de muestras es crucial para el éxito de la separación y purificación de proteínas. Las muestras deben protegerse de condiciones extremas como calor, ácidos y álcalis, y se debe tener cuidado para evitar la degradación y oxidación de las proteínas. Mantener lo más frío posible durante la manipulación y utilizar agentes protectores.
2. Elija un método de separación adecuado: Elija un método de separación adecuado en función de las propiedades de la proteína objetivo y el nivel de purificación requerido. Diferentes métodos de separación son adecuados para diferentes tipos y propiedades de proteínas. Si es necesario, se pueden combinar varios métodos para la purificación.
3. Higiene del laboratorio y habilidades operativas: la separación y purificación de proteínas debe realizarse en un entorno experimental limpio para evitar la contaminación y la infección cruzada. Los operadores de laboratorio deben seguir buenos estándares de higiene del laboratorio y utilizar desinfectantes para la limpieza para evitar la contaminación por proteínas no relacionadas.