El principio de la minipreparación de plásmidos y las precauciones durante el proceso de extracción son los siguientes:
En la extracción de plásmidos, se debe utilizar líquido bacteriano fresco y las bacterias se pueden extraer varias veces. en la fase logarítmica, la tasa de extracción de plásmido es la más alta. Las bacterias sobrecultivadas pueden tener bacterias muertas e impurezas. Las bacterias envejecerán y el ADN se degradará. La cantidad de líquido bacteriano también debe ser adecuada, de lo contrario, fácilmente no se lisará lo suficiente. afectando seriamente el rendimiento y la pureza.
Durante la extracción del plásmido, P1 debe suspender las células bacterianas y almacenarlas a baja temperatura; de lo contrario, también afectará la eficiencia de la extracción del plásmido. P2 contiene SDS e hidróxido de sodio, que utiliza un álcali fuerte para escindir el ADN y. libere plásmidos, por lo que el tiempo no debe ser demasiado largo y debe invertirse y mezclarse suavemente, y no debe exceder los 5 minutos; de lo contrario, el ADN puede fragmentarse en fragmentos cortos y mezclarse en el plásmido.
Al agregar P3 y operar con varias muestras, es mejor mezclar un tubo después de cada adición. P3 puede restaurar el pH después de la adición. El precipitado floculante producido es principalmente proteína y plásmido escindido. , pero el ADN no. Si todavía queda suspensión de proteínas después de la centrifugación, puede centrifugar nuevamente o extender el tiempo de centrifugación.
El mejor pH de WB es 7,5. Lo mejor es agregar la pipeta en ángulo durante la elución, lo que puede eliminar la sal en la pared del tubo y evitar agregarla directamente verticalmente para afectar el recubrimiento, de modo que para no reducir la eficiencia de extracción y también puede extender el tiempo de elución y aumentar el efecto de elución.
Instrucciones para la extracción de plásmidos
La glucosa en P1 aumenta la viscosidad, reduce la fuerza de corte mecánico, previene la rotura del ADN y asegura la suspensión bacteriana. El EDTA es un agente quelante que se combina con iones metálicos especialmente con calcio. y los iones de magnesio reducen la degradación del ADN por la ADNasa.
El NaOH y el SDS en P2 pueden lisar células, desnaturalizar el ADN y las proteínas y formar una estructura de red entrecruzada para precipitarlos y eliminarlos. La alcalinidad es demasiado fuerte, por lo que no se puede dejar por mucho tiempo. No es necesario dejarlo reposar y no lo agite con fuerza. Los fragmentos de ADN genómico rotos pueden mezclarse con los plásmidos.