Principio del método de dos híbridos de levadura:
Los factores de transcripción eucariotas típicos, como GAL4, GCN4, etc., contienen dos dominios diferentes: Dominio de unión al ADN (dominio de unión al ADN) y dominio activador de la transcripción.
El primero puede reconocer secuencias específicas en el ADN y posicionar el dominio de activación de la transcripción aguas arriba del gen regulado. El dominio de activación de la transcripción puede interactuar con otros componentes del complejo de transcripción para activar los genes que regula la transcripción del gen.
Información ampliada:
El sistema de dos híbridos de levadura puede medir la unión a proteínas in vivo y es muy sensible. Principalmente debido a:
1. El uso de vectores de expresión con alto número de copias y promotores fuertes sobreexpresa proteínas híbridas.
2. La medición de la señal se realiza en condiciones de concentración de equilibrio natural, y los métodos físicos como la inmunoprecipitación requieren múltiples lavados para lograr esta condición, lo que reduce la intensidad de la señal.
3. La estabilidad de las proteínas híbridas se puede mejorar mediante la combinación del dominio de activación y el dominio de unión para formar un complejo de iniciación de la transcripción, que a su vez se une al ADN promotor. Este complejo ternario permite a cada uno de ellos. ellos a La combinación de componentes tiende a ser estable.
4. Se producen una variedad de enzimas estables a través del ARNm para amplificar la señal. Al mismo tiempo, los métodos de detección como el fenotipo de levadura, la expresión de la proteína X-Gal y HIS3 son todos muy sensibles.
En el proceso de estudiar las características estructurales, funcionales y el modo de acción de las proteínas, a veces es necesario destruir las interacciones entre proteínas mediante mutación, adición de inhibidores y otros medios. En respuesta a esta necesidad en el trabajo práctico, Vidal et al. desarrollaron el llamado sistema de dos híbridos inversos.
La clave de esta tecnología es la introducción del gen informador URA3. El gen URA3 desempeña aquí un papel de contraselección y la enzima que codifica es una enzima clave en la síntesis de uracilo.
Enciclopedia Baidu - Levadura bihíbrida