La citometría de flujo tradicional utiliza grupos fluorescentes como moléculas informadoras para determinar la expresión de las moléculas diana cuantificando la intensidad de la luz emitida. Sin embargo, los espectros de emisión de los grupos fluorescentes a menudo se superponen, especialmente en la misma célula. En el caso de mediciones multiparamétricas en experimentos, es difícil distinguir múltiples fluoróforos. La citometría de masas utiliza metales lantánidos estables de un solo peso molecular como moléculas informadoras en lugar de grupos fluorescentes. El espectrómetro de masas elemental puede distinguir con precisión diferentes masas atómicas a través del peso molecular. No hay superposición de señales entre diferentes masas de metales lantánidos, lo que aumenta la precisión de la cuantificación.
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Actualmente, el citómetro de masas puede detectar 51 proteínas objetivo al mismo tiempo, a 1.000 células por segundo 100 muestras por día en promedio. El límite mínimo de detección es de 100 copias de moléculas y hay más de 400 anticuerpos marcados con metales lantánidos verificados. Además de las proteínas convencionales, la citometría de flujo de masas también se puede utilizar para detectar modificaciones postraduccionales de proteínas1, productos de degradación de proteínas5, tasa de supervivencia celular, tamaño celular, expresión de transcripción de ARNm6, tasa de síntesis de ADN7 y actividad de proteasa8.
Al igual que la cuantificación sin etiquetar en proteómica, la precisión de la cuantificación del objetivo mediante citometría de masas también se ve afectada por las diferencias en la eficiencia de ionización de los diferentes instrumentos y el estado de los mismos. Al mismo tiempo, la citometría de masas tradicional sólo puede detectar una muestra a la vez y tiene un rendimiento bajo. Por lo tanto, surgió el código de barras celular de etiqueta masiva (MCB).
Después de tratar las células con fármacos, se fijan con paraformaldehído y luego se utiliza reactivo MCB para marcar las células de diferentes muestras. Las diferentes muestras se mezclan y pretratan, y se detectan con una masa convencional. citómetro de flujo espectrómetro. Finalmente, las muestras de células se clasifican mediante la detección de iones elementales correspondientes a los códigos de barras.
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Figura 2. Citometría de masas multicanal
Los pasos experimentales de la citometría de masas multicanal se muestran en la Figura 2. Se fijaron diferentes muestras procesadas con formaldehído y se marcaron diferentes muestras con diferentes moléculas de mDOTA, y luego se preprocesaron y detectaron mediante citometría de flujo de espectrometría de masas convencional.
La molécula mDOTA utilizada aquí es un compuesto bifuncional. Un extremo puede quelar iones metálicos y el otro extremo puede unirse a grupos sulfhidrilo libres en proteínas intracelulares en forma de enlaces de valencia (Figura 3). Una molécula de mDOTA puede quelar un átomo de metal de lantánido, entonces, ¿por qué se llama código de barras? El código de barras se refiere a moléculas mDOTA que pueden quelarse con múltiples elementos metálicos lantánidos al mismo tiempo. Después de romper el enlace de valencia * * * en CyTOF, los picos de cada elemento metálico lantánido se pueden formar con o sin. Cuantos más tipos de reactivos mDOTA quelaten con elementos metálicos lantánidos, más tipos de códigos de barras se formarán eventualmente. Como se muestra en la Figura 4, 7 reactivos mDOTA quelados con elementos metálicos de lantánidos pueden formar 27 códigos de barras, que se pueden marcar simultáneamente. Al utilizar MCB, se puede utilizar una celda para analizar cuantitativamente varias muestras al mismo tiempo, lo que aumenta el rendimiento analítico del citómetro de flujo del espectrómetro de masas y mejora la precisión cuantitativa relativa. Las células madre mencionadas al principio de este artículo utilizan la tecnología MCB para estudiar la expresión y regulación de factores de transcripción endógenos durante la eritropoyesis humana a nivel de una sola célula.
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Figura 3.
El principio de reacción molecular de M DOTA
Las células están marcadas con la molécula bifuncional mdota (maleimida-monoamida-dota) en forma de * * * enlace de valencia. Un extremo de mDOTA puede quelar elementos de tierras raras y el otro extremo puede reaccionar con los grupos sulfhidrilo de proteínas intracelulares.
Sin embargo, MCB también tiene algunas deficiencias. Primero, la sensibilidad de detección de iones de un citómetro de flujo de espectrómetro de masas cambiará cada vez que se calibre el instrumento. Aunque se puede utilizar una referencia interna para la calibración, mezclar las muestras para la detección reducirá el grado de variación entre las muestras. En segundo lugar, los elementos metálicos lantánidos utilizados en MCB no pueden ser los mismos que los metales lantánidos a los que se acoplan los anticuerpos utilizados posteriormente, por lo que el uso de MCB limita la selección de anticuerpos marcados posteriores. Por lo tanto, los reactivos MCB a base de paladio se desarrollaron más tarde11. El uso de seis átomos isotópicos de paladio para construir moléculas de MCB tiene las dos ventajas siguientes: en primer lugar, el paladio es incompatible con el reactivo para marcar anticuerpos (polímero basado en DTPA), por lo que el uso de paladio en la molécula de MCB no interferirá con la selección posterior. de anticuerpos marcados; en segundo lugar, el Pd tiene seis isótopos estables, 102, 104, 105, 106, 108 y 10AMU, con una pureza del 91% respectivamente.
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Figura 4. El principio de formación del microdisyuntor
Usando 7 tipos de reactivos mDOTA quelados con metales con lantánidos, agregando reactivos mDOTA de acuerdo con la distribución en la figura se puede formar un código de barras de potencia del 2 al 7, que puede etiquetar 128 muestras al mismo tiempo. mismo tiempo.
Por último, hablemos brevemente de las ventajas y desventajas de esta tecnología. La ventaja es que puede detectar muchos canales al mismo tiempo, y ahora puede detectar 51 proteínas objetivo al mismo tiempo, es altamente operable y los reactivos se comercializan aunque la velocidad no es tan rápida como el citómetro de flujo (10.000); células por segundo), tampoco es lento, cada segundo puede detectar 1000 células. De bajo costo, el costo promedio de medición por célula es de solo 0,005 centavos, lo cual es bastante barato en comparación con la tecnología de secuenciación unicelular, que promedia $22 por célula.
Por supuesto, esta tecnología todavía tiene muchas deficiencias. En primer lugar, las células se atomizan e ionizan durante el análisis y no se puede conservar el estado completo de las células vivas después del análisis. En segundo lugar, la sensibilidad es menor que la de los grupos fluorescentes y no se pueden detectar moléculas con niveles de expresión extremadamente bajos y la dinámica; el rango de detección solo puede llegar a 3 -4 veces, mientras que el rango de detección de los grupos fluorescentes puede alcanzar aproximadamente 50 veces, en tercer lugar, la eficiencia de ionización de diferentes instrumentos es diferente y es necesario agregar perlas de poliestireno para corregir la intensidad de la señal; para lograr la comparación de datos del mismo instrumento; cuarto, y Al igual que los citómetros de flujo basados en fluoróforos, los citómetros de flujo de espectrometría de masas aún no pueden detectar metabolitos de moléculas pequeñas y no pueden monitorear una célula de manera continua y dinámica. Por último, y lo más importante, no podemos controlar todas las proteínas del proteoma, sólo proteínas diana específicas, por lo que se requiere un diseño experimental más riguroso.
En cualquier caso, la tecnología de citometría masiva todavía se está desarrollando y mejorando, y cada vez se pueden resolver más problemas con esta tecnología. Espero que esta introducción sistemática a la citometría de flujo por espectrometría de masas también pueda proporcionar algunas ideas nuevas para los problemas que enfrentamos actualmente y contribuir a nuestro proyecto. (Fuente: Plataforma de Histología y Química de Proteínas del Centro de Tecnología de Investigación de Proteínas, Universidad de Tsinghua)
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